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核苷及其衍生物在抗病毒和抗腫瘤方面的作用近年來越來越引起人們的關(guān)注。 1992 年 C .Perigaud 等人對(duì)核苷類抗病毒藥物進(jìn)行了綜述。2′ -脫氧鳥苷是合成寡脫氧核苷酸等多種抗病毒 、抗腫瘤核酸藥物的重要原料，在市場(chǎng)上有廣泛需求。脫氧鳥苷很難用化學(xué)合成法進(jìn)行合成，到現(xiàn)在為止仍沒有成熟的化學(xué)合成脫氧鳥苷方法的報(bào)道。
現(xiàn)在獲得脫氧鳥苷的方法主要是采用以 DNA為原料，先用核酸酶水解生成脫氧核苷酸，然后再用磷酸單酯酶水解，使其生成脫氧核苷，此方法成本高，而且 DNA 來源有限，大規(guī)模生產(chǎn)會(huì)受到限制。關(guān)于酶法合成脫氧鳥苷的報(bào)道，日本橫關(guān)鍵三等應(yīng)用肺炎克雷伯氏菌( K lebsiella pneumoni -ae) 生成脫氧鳥苷的方法，但轉(zhuǎn)化率僅為28 %。
使用產(chǎn)氣腸桿菌為酶源，以 2 ′ -脫氧尿苷和鳥苷為底物，2 ′ -脫氧鳥苷轉(zhuǎn)化率僅為 18 %。其它亦有用胸苷和 2，6-二氨基嘌呤生成 2，6-二氨基 2′ -脫氧核苷，再用腺苷脫氨酶處理得到脫氧鳥苷的方法，但工藝步驟多，成本較高。
2＇-脫氧鳥苷是一種天然的脫氧核苷，可直接用于制備組合脫氧核苷藥物或者作為化學(xué)試劑用于生化研究；同時(shí)可作為中間體用于合成一些抗病毒核苷類藥物以及分子標(biāo)記物，如以2’-脫氧鳥苷原 料合成8-溴-2’-脫氧鳥苷和8-羥基-2’-脫氧鳥苷等重要分子標(biāo)記物；合成2’-脫氧鳥苷的6位衍生物，如6-甲氧基、6-氨基等系列重要抗腫瘤的2’-脫氧鳥 苷衍生物。
另外采用2’-脫氧鳥苷為原料合成致癌或抗癌過程中的重要分子標(biāo)記物N7-鳥嘌呤烷化物，該方法是以2′-脫氧鳥苷為原料，以碘乙烷、環(huán)氧乙烷、1-溴-2-氯乙烷、3-溴丙烯或1，2-二溴乙烷作為烷化劑，在二甲基亞砜、冰醋酸或二甲基乙酰胺溶液中，于15~50℃，反應(yīng)0.5~96h，反應(yīng)完畢后進(jìn)行減壓蒸餾，粗產(chǎn)品經(jīng)硅膠柱層析分離純化，用乙酸乙酯∶石油醚(體積比)=10~20∶1和乙酸乙酯∶無水甲醇(體積比)=10~20∶1洗脫液分別洗脫，得到N7-鳥嘌呤烷化物。方法具有反應(yīng)條件溫和、分離純化過程簡(jiǎn)單、產(chǎn)物收率高、對(duì)環(huán)境污染較少等優(yōu)點(diǎn)，有利于N7-鳥嘌呤烷化物的大量生產(chǎn)。
方法1：利用產(chǎn)核苷磷酸化酶的乙酰短桿菌細(xì)胞酶法合成 2′ -脫氧鳥苷，其可能的反應(yīng)機(jī)理如圖 1所示：
以脫氧胸腺嘧啶核苷( Thymidine，dTR) 為脫氧核糖的供體，鳥苷酸(GM P) 為堿基鳥嘌呤的供體，在核苷磷酸化酶的作用下合成脫氧鳥苷。該實(shí)驗(yàn)還優(yōu)化了其酶反應(yīng)條件，從而得到 56.4 %的胸苷轉(zhuǎn)化率，并使用離子交換法分離得到了純度90.2 %的脫氧鳥苷。它具有步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間較短，產(chǎn)物分離比較容易等優(yōu)點(diǎn)。具體步驟如下：
1）乙酰短桿菌的培養(yǎng)和濕菌體制備：在1 L的帶擋板的錐形瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基 200 mL，于 121 ℃滅菌 20 min，冷卻后從新鮮、長(zhǎng)勢(shì)良好的乙酰短桿菌斜面上接種，36 ℃培養(yǎng) 16 h，然后將培養(yǎng)液 10 000 r/min 離心 10 min，棄去上清液，所得菌體用 30 mm ol/ L 磷酸鹽緩沖液( pH 7.0)洗滌2 ～ 3次，作為酶源冷凍備用。
2）脫氧鳥苷酶法合成及工藝優(yōu)化：20mmol/L 的脫氧胸腺嘧啶核苷( dTR)，20 mm ol/ L的鳥苷酸 (GMP )，5 % 的濕菌體，100 m L30 mmol/L pH 6.98 磷酸鹽緩沖液作為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物，在60 ℃的恒溫水浴槽中攪拌反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為 6h。在不改變其它條件的情況下，依次考察不同的反應(yīng)溫度、菌體量、反應(yīng) pH、磷酸鹽緩沖液濃度、底物濃度、底物比率和反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶反應(yīng)的影響，優(yōu)化其反應(yīng)條件。
3）酶反應(yīng)液中脫氧鳥苷的分離純化：取適量的脫氧鳥苷反應(yīng)液，高溫滅活后用硅藻土過濾，在其中加入 5 mmol/L 的四硼酸鈉，再通過 pH 中性的氯型陰離子樹脂進(jìn)行分離，以 0.5 倍柱體積每小時(shí)的流速上樣洗脫，上樣結(jié)束后用 0 ～ 0.2 mol/L的 NaCl 進(jìn)行梯度洗脫，分布收集洗脫液。取收集到的脫氧鳥苷洗脫液脫鹽濃縮結(jié)晶，得到脫氧鳥苷樣品。
方法2：一種核苷類藥物中間體2’-脫氧鳥苷的生產(chǎn)方法，是采用產(chǎn)脫氧核苷核糖轉(zhuǎn)移酶 的發(fā)酵乳桿菌CGMCC 1.1880菌體漿狀物為生物催化劑，在聚乙二醇（PEG）/無機(jī)鹽雙水相轉(zhuǎn)化體系，以β-胸苷和鳥嘌呤為原料進(jìn)行酶促反應(yīng)，最后獲得2’-脫氧鳥苷。所述的雙水相轉(zhuǎn)化體系中所用多聚物為聚乙二醇，所選的種類有PEG4000、 PEG8000、PEG10000、PEG15000和PEG20000。其優(yōu)選為PEG10000和PEG15000，其最優(yōu)選為 PEG10000。
所述聚乙二醇的濃度為25g/L-55g/L，包括 25g/L、45g/L和55g/L，優(yōu)選 PEG10000的的濃度為45g/L。雙水相轉(zhuǎn)化體系中所用無機(jī)鹽為磷酸鹽，所選的鹽種類有磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉和磷酸二氫銨，優(yōu)選為磷酸二氫鉀。磷酸鹽的濃度為30g/L-60g/L，包括30g/L、 45g/L和60g/L，優(yōu)選磷酸二氫鉀的濃度為45g/L。底物為β-胸苷和鳥嘌呤，其中β-胸苷濃度為16.5g/L，鳥嘌呤所選的濃度為10.3g/L-18.0g/L，包括10.3g/L、15.2g/L和18.0g/L，優(yōu)選濃度為15.2g/L；β-胸苷和鳥嘌呤摩爾比為1：1-2，包括1：1、1：1.5和1：2，優(yōu)選的比例為1：1.5。
β-胸苷是目前五種脫氧核苷（2’-脫氧腺苷、2’-脫氧尿苷、2’-脫氧胞苷、2’-脫氧 鳥苷和β-胸苷）中最易得、價(jià)廉的脫氧糖基供體，而鳥嘌呤相比于其它含鳥嘌呤結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如鳥苷、鳥苷酸或者2，6-二氨基嘌呤等，是最為直接、易得和價(jià)廉的脫氧核糖受體，因此，采用生物催化法制備2’-脫氧鳥苷，鳥嘌呤和β-胸苷作為初始底物是最理想的組合。
方法3：一種用乙酰短桿菌的核苷磷酸化酶合成2’-脫氧鳥苷的方法，包括如下步驟：
(1)將乙酰短桿菌(Brevibacteriumacetylicum)QD96-CGMCCNo.0472接入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)獲得的菌體作為核苷酸磷酸化酶?jìng)溆?；所述培養(yǎng)基為常規(guī)的，其組分和重量含量包括：牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，NaCl0.5％，pH為7.0；
(2)然后將步驟(1)獲得的菌體加入底物溶液，所述底物溶液中，脫氧核糖受體的含量為5～40mol/L，脫氧核糖供體濃度為5～40mol/L，磷酸緩沖液濃度為10～50mmol/L，菌體的濕重加入重量為1～5％，40～65℃反應(yīng)1～4h，離心，獲得溶液含有2’-脫氧鳥苷的溶液，溶液經(jīng)HPLC檢測(cè)，2’-脫氧鳥苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)60％，然后從反應(yīng)產(chǎn)物中收集2’-脫氧鳥苷；所述的脫氧核糖受體選自鳥嘌呤、鳥苷或鳥苷酸，但由于鳥嘌呤在水中溶解度較低，其中以鳥苷酸為最佳；所述的脫氧核糖供體選自2’-脫氧核糖、2’-脫氧核糖-1-磷酸，胸苷、2’-脫氧尿苷或2’-脫氧胞苷等，但從目前原料來源難易和價(jià)格因素考慮，選擇胸苷、2’-脫氧尿苷或脫氧核糖較好。
[1] 李喻, 竇潔, 曹靜, 邱蔚然, & 周長(zhǎng)林. (2011). 乙酰短桿菌酶法合成 2′-脫氧鳥苷.藥物生物技術(shù),18(2), 119-123.
[2] CN201510140553.1一種核苷類藥物中間體2’-脫氧鳥苷的生產(chǎn)方法
[3] CN201110114010.4N7-鳥嘌呤烷化物的制備方法
[4] CN201010611733.0用乙酰短桿菌的核苷磷酸化酶合成2’-脫氧鳥苷的方法