手機(jī)掃碼訪問本站
微信咨詢
酯酶廣泛存在于生物體內(nèi)的水解脂類的水解酶。一般包括三類：①A酯酶：主要水解芳香族酯類；②B酯酶：主要水解脂肪族酯類；③C酯酶：主要水解酸分子為酷酸的酯類。其中以B酯酶最主要，幾乎所有的哺乳動(dòng)物的組織中都含有B酯酶，其中以肝臟中含量最高，主要位于肝細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。
酯酶屬于α/β水解酶家族，其空間結(jié)構(gòu)如示意圖。
這種α/β水解酶折疊具有Ser-His-Asp構(gòu)成的催化中心三聯(lián)體，其中Ser通常存在于一段保守五肽Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly結(jié)構(gòu)中間。脂肪酶屬于絲氨酸族，整個(gè)分子主要由兩部分組成，即親水部分和疏水部分，事實(shí)上，脂肪酶的立體結(jié)構(gòu)一般是肽鏈折疊成N-末端、C-末端和活性位點(diǎn)（activesite）組成。
其活性位點(diǎn)由催化三聯(lián)體構(gòu)成，催化三聯(lián)體主要包括絲氨酸（Ser），組氨酸（His）和天冬氨酸（Asp）或谷氨酸（Glu）殘基，Ser殘基是親核部分，His是基本組成部分，Asp或Glu是酸部分。它們在酶中是以不同的折疊方式存在的，不同的折疊方式代表不同的一級結(jié)構(gòu)，比如RML(RhizomucorMieheiLipase）為Ser144-His267-Asp203，HPL(HumanPanereatieLipase)則為Ser152-His263-Asp176，但它們都通過肽鏈的α-螺旋盤繞、β-折疊形成高度相似的空間結(jié)構(gòu)，且疏水端靠近分子的活性中心脂肪酶的活性中心被一段親水性的α-螺旋“蓋子（Lid）”覆蓋，這個(gè)結(jié)構(gòu)使脂肪酶產(chǎn)生界面激活效應(yīng)。
酯化酶具有多向合成功能，既能催化酯的合成，也能催化酯的分解。因此測定酯化酶酶活可供選擇的方法也比較多。在酯化酶的研究中，目前還沒有統(tǒng)一的測活方法，缺乏方便、準(zhǔn)確的活力測定方法始終是一個(gè)難點(diǎn)，雖然己報(bào)道的測定方法很多，如滴定法、比色法、紙層析法、分光光度法、熒光法和色譜法等等。但這些方法中有的儀器設(shè)備要求高、步驟繁冗，有的靈敏度及穩(wěn)定性較差；有的在測定中難以排除其它的干擾。
1）中和滴定法傳統(tǒng)酯化力測定是先用堿中和酯化液中的游離酸，再加入一定量的堿使酯皂化，用酚酞作為指示劑，過量的堿用酸進(jìn)行反滴定（GB/T10345.5-89）。后以正庚烷為有機(jī)溶劑來代替水相進(jìn)行酯化力測定，建立有機(jī)相反應(yīng)體系快速測定。優(yōu)化以后的測定與傳統(tǒng)方法相比具有很大優(yōu)點(diǎn)，主要體現(xiàn)在傳統(tǒng)酯化力測定方法操作復(fù)雜，耗時(shí)長。采用在有機(jī)相中反應(yīng)的方法來測定大曲的酯化力，則相對比較簡單，且檢測時(shí)間100h可以縮短至24h，有利于大生產(chǎn)中快速檢測。使得優(yōu)化后的方法更加適用于實(shí)際生產(chǎn)中的測定。
2）電位滴定法（GB/T10345.5-89）
向試劑中滴加能與待測物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的一定濃度的試劑，并在滴定過程中，監(jiān)測指示電極的電位變動(dòng)，根據(jù)反應(yīng)達(dá)到物質(zhì)的量的點(diǎn)，待測物質(zhì)濃度的突然改變所引起電極電位的改變，來確定終點(diǎn)的定量分析方法。對于沒有合適指示劑的滴定以及深色或混濁溶液等難于用指示劑判斷終點(diǎn)的滴定特別有利，對于滴定突躍小難于用批示劑指示終點(diǎn)的滴定，如采用新操作技術(shù)可得到滿意結(jié)果。用電位滴定法測定酯化力，采用反滴定，當(dāng)接近等當(dāng)點(diǎn)時(shí)，氫離子濃度發(fā)生急劇變化，利用pH變化最大的突躍點(diǎn)指示終點(diǎn)?？偟膩碚f，滴定法用堿使酯被皂化，然后用酸反滴定，但該法不好掌握，同時(shí)準(zhǔn)確率不是特別高；精確度差。
1）催化酯化類：比色法的研究根據(jù)在堿性溶液條件下，試樣中的酯類與羥胺生成異羥肟酸鹽，酸化后，與鐵離子形成棕黃色的配合物，在一定的酒精濃度下，酯的含量與棕黃色配合物在525nm波長的吸光度成正比，并對試驗(yàn)條件及其影響因素進(jìn)行了研究，確定了最佳方案，在一定的范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系。
2）底物比色法的研究測定酯化酶酶活所使用的底物也有限，常用于檢測酯酶活力的底物有：對硝基苯乙酸酯、對硝基苯丁酸酯、醋酸-α-萘酯、對硝基苯棕櫚酸酯、橄欖油等。以1mmol/L對硝基苯乙酸酯為底物，加磷酸緩沖液（0.05mol/L，pH6.5）2.3mol和粗酶液0.2mL混合，置于50℃水浴中振蕩反應(yīng)10min，釋放出的對硝基苯酚用分光光度計(jì)在405nm處測定；以10mmol/L對硝基苯丁酸酯為底物溶解在異丙醇中配成底物溶液，另一部分為50mmol/LTris-HCl緩沖液（pH8.5）、0.1%的阿拉伯樹膠粉、0.6%TritonX-100，將底物溶液與緩沖溶液按體積比為1∶9混合后配成底物緩沖液，取1.9mL底物緩沖液及0.1mL粗酶液于30℃反應(yīng)15min，釋放出的對硝基苯酚用分光光度計(jì)在405nm處測定；以醋酸-α-萘酯為底物，在37℃pH6.0的酸性環(huán)境中經(jīng)酯酶可以使醋酸-α-萘酯水解為α-萘酯和乙酸，α-萘酯與顯色劑固蘭B鹽作用形成形成紅色偶氮化合物。利用該原理，測定該物質(zhì)的吸光度值變化即知酶的活性大小。比色法具有快速方便。靈敏度高等的特點(diǎn)。但需要能找到合適特異性強(qiáng)的底物。
紙上層析法在發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用廣泛，江蘇雙溝酒業(yè)股份有限公司和中國藥科大學(xué)開發(fā)新產(chǎn)品植物激素——脫落酸。也可以用紙上層析或薄層層析定性分析甚至可以定量分析，它有設(shè)備簡單、樣品量少和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但展開時(shí)間較長是其缺點(diǎn)，所配部分試劑也不能放置時(shí)間過長。
在脂肪酶作用下，脂肪水解為甘油及游離脂肪酸。游離脂肪酸可和堿性銅鹽結(jié)合成銅皂，在有機(jī)溶劑中，銅皂進(jìn)一步和顯色劑DCPI，5—二苯基卡巴蹤結(jié)合，形成櫻紅色溶液，在脂肪酸含量為10nmol~150nmol的范圍內(nèi)，顯色程度和脂肪酸含量呈良好的線性關(guān)系。在550nm的波長下測定，可測出反應(yīng)體系在單位時(shí)間內(nèi)游離脂肪酸含量的變化，以此作為脂肪酶活性的指標(biāo)。
利用高熒光效率的石墨烯量子點(diǎn)（GQDs）作為傳感元件，設(shè)計(jì)組裝GQDs脂肪酶活熒光傳感器。當(dāng)Hg2+存在時(shí)，Hg2+通過靜電吸引作用吸附在GQDs表面，導(dǎo)致GQDs熒光被猝滅；加入脂肪酶及其底物巰基乙酸甲酯（MT），脂肪酶能夠水解其底物生成巰基乙酸（TGA），TGA與Hg2+之間具有更強(qiáng)的結(jié)合力，從而使Hg2+從GQDs表面釋放出來，GQDs的熒光又重新恢復(fù)，且熒光恢復(fù)強(qiáng)度與脂肪酶的活性有關(guān)，因此可以利用此熒光傳感策略來定量檢測脂肪酶活。在最優(yōu)條件下，測得的脂肪酶檢出線性范圍為0.05mg/mL~1.6mg/mL，檢出限為2.77×10-4mg/mL。該方法還測定了另外四種商品化脂肪酶的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與恒電位滴定法測定結(jié)果一致，證明該方法具有良好的實(shí)用性。此外，與傳統(tǒng)的比色法相比，該方法具有更高的靈敏度和選擇性，簡單方便且可用于高通量、實(shí)時(shí)檢測脂肪酶活性。
氣相色譜是機(jī)械化程度很高的色譜方法。色譜法也是目前最有效、最準(zhǔn)確的測定酯化力方法.在色譜法測定大曲酯化力時(shí)，要處理好樣品。其色譜條件也是影響測定結(jié)果準(zhǔn)確率的較為重要條件，這一點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)室、企業(yè)色譜條件的不同而帶來結(jié)果的差異。
[1]衛(wèi)生學(xué)大辭典
[2]中華法學(xué)大辭典·訴訟法學(xué)卷
[3]白酒釀造中酯酶及己酸乙酯的研究進(jìn)展