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乳過氧化物酶屬氧化還原酶類。編號(hào)：EC1.11.1.7。存在于牛乳、眼淚、唾液等體液中的一種過氧化物酶，催化過氧化氫氧化底物并生成水。乳過氧化物酶（Lactoperoxidase，LPO）是過氧化物酶家族的成員之一，廣泛分布于自然界中，包括人類、植物和動(dòng)物體內(nèi)，是乳中天然含有的一種酶類。乳過氧化物酶存在于哺乳動(dòng)物的乳腺、唾液和淚液腺體及其各自的分泌物，即牛奶、唾液和眼淚。它是牛乳和人乳中常見的成分之一，并且存在于迄今為止已經(jīng)檢測(cè)過的所有哺乳動(dòng)物乳中。乳過氧化物酶是發(fā)現(xiàn)的首個(gè)分泌型過氧化物酶，且在保護(hù)哺乳期婦女的乳腺以及新生兒腸道免受病原微生物侵害方面起重要作用，是機(jī)體防御體系的一部分。乳腺、唾液和淚腺中的過氧化物酶在化學(xué)和免疫學(xué)上性質(zhì)相似。
LPO是牛乳中含量最豐富的酶之一，是一種等電點(diǎn)（pI）為15的堿性蛋白，由1條多肽鏈構(gòu)成，包括612個(gè)氨基酸殘基和15個(gè)半胱氨酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量約78kDa。含鐵量0.07%，含有1個(gè)血紅素（正鐵血紅素），其折疊結(jié)構(gòu)包括23%α-螺旋、65%β-折疊和12%無序結(jié)構(gòu)。人類蛋白質(zhì)的氨基酸序列也有612個(gè)殘基，包括16個(gè)半胱氨酸。作為一種糖蛋白，LPO含有4~5個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，碳水化合物含量約10%。對(duì)于某個(gè)給定的LPO，糖基化和部分脫酰胺化的差異可引起顯著的色譜和電泳異質(zhì)性，牛乳中乳過氧化物酶（bLPO）具有至少10個(gè)酶活性相似的級(jí)分。LPO中含有一個(gè)鈣離子，它能與LPO緊密地結(jié)合，穩(wěn)定其分子構(gòu)象，因此鈣離子在LPO的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)完整性中起重要作用。脊椎動(dòng)物過氧化物酶（乳過氧化物酶（LPO）、甲狀腺過氧化物酶（TPO）、髓過氧化物酶（MPO）和嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶（EPO））的活性位點(diǎn)是血紅素，一種原卟啉IX衍生物，通過2個(gè)酯鍵共價(jià)結(jié)合到遠(yuǎn)端天冬氨酸和谷氨酸殘基。這些對(duì)脊椎動(dòng)物過氧化物酶特異性的共價(jià)鍵導(dǎo)致血紅素的對(duì)稱性和平面性的改變，從而產(chǎn)生了這些蛋白質(zhì)獨(dú)特的光譜性和氧化還原性質(zhì)。序列分析顯示，人乳過氧化物酶（hLPO）分別與人髓過氧化物酶（hMPO）、人嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶（hEPO）和人甲狀腺過氧化物酶（hTPO）有57%，58%和46%的序列同一性。這些高水平的序列同一性表明，半胱氨酸過氧化物酶（XPO）亞科的種酶可能具有顯著的結(jié)構(gòu)相似性。
1. 熱穩(wěn)定性
研究表明，LPO在滲透物和緩沖液中的熱穩(wěn)定性小于在乳清或乳汁中，鈣離子濃度似乎對(duì)其熱敏性有較大影響，且熱變性的起始溫度為70℃。LPO在酸性條件（pH5.3）下的熱穩(wěn)定性較差，其原因可能是由于分子中鈣的釋放。LPO是牛奶中熱穩(wěn)定性最強(qiáng)的酶之一，其被破壞程度已被用作牛乳巴氏滅菌效率的指標(biāo)。LPO僅在74℃通過短時(shí)間的巴氏滅菌被部分滅活，剩余活性來催化硫氰酸鹽和過氧化氫之間的反應(yīng)。
2. pH
在pH4.4~6.7的范圍內(nèi)，LPO為低質(zhì)量濃度（0.5mg/L），pH5.4時(shí)的活性降低最快，每15min降低15%；而LPO濃度為高質(zhì)量濃度（25mg/L），3h內(nèi)不喪失活性。這種差異可能是由于在低濃度下LPO對(duì)玻璃容器表面的吸附作用，并且表明在測(cè)定LPO最終稀釋濃度時(shí)必須快速進(jìn)行分析。LPO在pH3時(shí)保存會(huì)失活，在pH＜4時(shí)部分變性，當(dāng)pH達(dá)10左右時(shí)則不會(huì)失活（室溫下）。使用2，2’-聯(lián)氮雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）作為底物，研究得出LPO催化反應(yīng)的最適pH為5~6，但取決于ABTS和H2O2的濃度。
3. 蛋白水解酶
LPO對(duì)許多蛋白水解酶穩(wěn)定。據(jù)報(bào)道，胰蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶不會(huì)使天然乳過氧化物酶失活，糜蛋白酶只能使其緩慢地失活。LPO不會(huì)被pH5的嬰兒胃液滅活，但會(huì)在pH2.5時(shí)被胃蛋白酶滅活。
4. 光化學(xué)
在核黃素存在的情況下，LPO似乎對(duì)光非常敏感。例如，LPO在10℃溫度下暴露6000lux持續(xù)4h后，在乳、乳清和滲透物中分別被滅活55%，75%和97%。在50mg/L的LPO緩沖溶液中（pH6.7），除非加入核黃素，否則不發(fā)生LPO的光化學(xué)滅活。光化學(xué)滅活不可逆，但通過加入半胱氨酸可以高效地防止光化學(xué)滅活現(xiàn)象。
在牛乳中，LPO是次于黃嘌呤氧化酶第二豐富的酶。其在牛乳中的質(zhì)量濃度約為30mg/L，約占乳清蛋白的1%。人乳中LPO約為0.77±0.38mg/L；純化后的日本香川地區(qū)荷斯坦牛乳與娟姍牛乳清蛋白中LPO含量分別為0.2729和0.3807 mg/mL。不同于其他的抗菌蛋白，牛初乳中的LPO濃度較低，然而在產(chǎn)后的3~5d，濃度可迅速增長到最大值。
1)反應(yīng)機(jī)理
LPO與硫氰酸鹽（SCN-）和過氧化氫（H2O2）共同存在時(shí)，才具有抗菌活性，稱為乳過氧化物酶體系（Lactoperoxidasesystem，簡稱LPOS），LPOS是乳中的一種天然抗菌體系。在H2O2存在的情況下，LPO催化氧化SCN-，產(chǎn)生HOSCN和OSCN-等氧化產(chǎn)物，氧化細(xì)菌蛋白質(zhì)的巰基（—SH），使其轉(zhuǎn)化為硫（氧）基衍生物，阻礙細(xì)菌的新陳代謝及增殖，從而達(dá)到抑制細(xì)菌的目的。雖然乳蛋白質(zhì)中也含有少量—SH基，但由于在自然狀態(tài)下是被包埋在分子內(nèi)部，不易與LPOS接近，所以O(shè)SCN-的主要作用是存在于乳中細(xì)菌表面上的—SH，對(duì)β-乳球蛋白等乳蛋白沒有影響。SCN-的氧化產(chǎn)物介導(dǎo)的LPO催化反應(yīng)來氧化蛋白質(zhì)（酶）巰基：
2)抑菌活性
不同種類的細(xì)菌表現(xiàn)出對(duì)LPOS不同程度的抗性。革蘭氏陰性的過氧化氫陽性菌如假單胞菌屬、大腸菌群、沙門氏菌屬和志賀氏桿菌不僅會(huì)被LPO抑制生長，且在外源提供H2O2以及適宜的培養(yǎng)基條件下（pH、溫度、孵育時(shí)間、細(xì)胞密度等），這些細(xì)菌可能會(huì)被直接殺死；革蘭氏陽性的過氧化氫陰性菌如鏈球菌和乳桿菌通常會(huì)被LPOS抑制但不會(huì)被直接殺死。上述細(xì)菌對(duì)LPO的敏感度差異可能是由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其屏障性質(zhì)的不同而形成的。I-是所有鹵化物中最容易氧化的，LPO催化I-產(chǎn)生I2，并且根據(jù)pH和I-濃度大小，還存在HIO和IO-。所以當(dāng)SCN-和I-都存在于LPOS時(shí)，反應(yīng)機(jī)理會(huì)更加復(fù)雜。在生物體液中，SCN-/I-比例通常為10︰100，并且SCN-能更有效地與I-競(jìng)爭(zhēng)LPO的催化氧化，表明I-的影響可以忽略不計(jì)。然而(SCN)2可將I-氧化成I2，使得在存在I-的情況下，SCN-的氧化可能間接產(chǎn)生I2。由于LPO-H2O2-SCN-系統(tǒng)主要發(fā)揮抑菌作用，而LPOH2O2-I-系統(tǒng)則為殺菌作用，因此即使只有少量的I-氧化，對(duì)于抗微生物活性都會(huì)有重要的影響。據(jù)報(bào)道，SCN-和I-作為電子給體，LPOS主要體現(xiàn)殺菌作用，并且還能有效地殺死酵母和霉菌。
開發(fā)LPO的最大問題是其分離過程煩瑣、純化困難、制造成本較高，難以實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，所以使用不同的分離純化技術(shù)來提取LPO一直是許多研究的重點(diǎn)，探索操作簡單方便、純化快速、成本低、效率高、開發(fā)潛力大的新型分離提純方法是今后要努力發(fā)展的方向。國外已有研究用不同的純化方法來提取LPO，如CM-Sephadex離子交換色譜法、Sephadexg-100凝膠過濾色譜法、苯基-瓊脂糖疏水親和層析、Toyopearl-SP陽離子交換層析法等。然而這些研究的純化方法比
較復(fù)雜且耗時(shí)長。此外，還有耦合IgG進(jìn)行陽離子交換色譜和免疫親和層析法，用于從乳清中提純LPO。用陽離子交換膜從牛乳清中分離LPO且結(jié)果顯示，通過梯度洗脫可以得到高純度LPO，但最大回收率為73%，需要進(jìn)一步提高。Pan等[38]制備一種嵌入球型纖維素的陽離子交換復(fù)合冷凍凝膠，用于從牛乳清分離LPO，獲得約92%的最大回收率，表明此發(fā)明的陽離子交換復(fù)合冷凍凝膠在從牛乳清分離少量蛋白如LPO中是非常有前景的，需要進(jìn)一步的驗(yàn)證和探索。還有研究使用硫酸銨沉淀和一步CM-纖維素陽離子交換層析法從牛乳清中分離高純度LPO，對(duì)工業(yè)應(yīng)用方面的發(fā)展可能會(huì)有一定幫助。通過使用Sepharose4B-L-酪氨酸-磺酰胺親和層析的方法從牛奶中一步純化LPO，回收率為62.3%，此純化方法可多次應(yīng)用，且成本較低，耗時(shí)較少；同時(shí)該研究結(jié)果表明磺胺對(duì)于LPO的動(dòng)力學(xué)特性及其競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，今后此方法有望指導(dǎo)其他過氧化物酶分離提純的開發(fā)。近年來，有研究通過使用染料親和層析從乳清中純化LPO，純化率最高可達(dá)86.5%±3.8%，純化因子為46.1±1.1，表明活性紅4-瓊脂糖凝膠可以應(yīng)用于一步純化牛乳中LPO，且使用不同色譜載體的染料親和層析直接從乳清中回收和純化LPO有不錯(cuò)的應(yīng)用前景。
中國在這方面的研究相對(duì)較少，如采用超濾-離子交換色譜分步洗脫法，對(duì)牛初乳中的LPO進(jìn)行分離和純化，結(jié)果顯示該酶回收率為76.17%，其最適pH為5.0~5.5，最適溫度為55℃。在70℃和75℃時(shí)LP酶活的熱失活曲線呈現(xiàn)一般植物過氧化物酶失活的雙相特征。采用強(qiáng)陽離子交換色譜梯度洗脫法，對(duì)牛乳中的LPO進(jìn)行分離和純化，利用SDSPAGE定性檢測(cè)，分離出的LPO顯示為單一區(qū)帶，相對(duì)分子質(zhì)量為76186U。該酶回收率為83.07%，純化倍數(shù)達(dá)44.63倍。近期有研究使用雙水相萃取技術(shù)從牛乳乳清中提取LPO，與一些傳統(tǒng)的分離方法相比，雙水相萃取技術(shù)所使用的分離設(shè)備簡單，在溫和條件下進(jìn)行簡單操作，其獲得產(chǎn)品的回收率和純度較高，其酶活回收率和純化倍數(shù)分別為153.59%和1.99倍。今后的研究側(cè)重于確定牛奶中分離純化LPO的純化程度和酶活性等，從而為LPO的大規(guī)模開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
[1] 營養(yǎng)科學(xué)詞典
[2] 乳過氧化物酶研究進(jìn)展
[3] CN201510367541.2一種采用超濾法輔助硫酸銨鹽析提取乳過氧化物酶的方法