9003-99-0 / 化學(xué)發(fā)光試劑：辣根過氧化酶、ECL、魯米諾?和增強(qiáng)發(fā)光酶反應(yīng)原理介紹

化學(xué)發(fā)光試劑辣根過氧化酶

辣根過氧化酶使試劑中的發(fā)光物（luminol）氧化并發(fā)光，而試劑中含有增強(qiáng)劑這使得發(fā)光增強(qiáng)了1000倍。在免疫印跡中，將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)sds-page分離，并轉(zhuǎn)移到固相膜上（如nc、pvdf）等，用于免疫學(xué)檢測，經(jīng)HRP標(biāo)記的抗體與膜上的蛋白直接（標(biāo)記一抗）或間接（標(biāo)記二抗）反應(yīng)。當(dāng)加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑后，luminol發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長為428nm的光，此光可經(jīng)x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。

用途：非放射性發(fā)光系統(tǒng)，用于檢測固定在膜上的蛋白，其敏感性達(dá)1-5pg。用x光片可快速地獲得永久的硬拷貝結(jié)果。所含獨(dú)特的底物足以維持12小時以上的發(fā)光，便于反復(fù)曝光操作，免疫印跡膜經(jīng)抗體脫卸處理后可供再次抗體探查使用。適用于痕量蛋白或核酸檢測。

使用方法

1. 印跡膜制備按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜操作，適當(dāng)?shù)姆忾]非常重要?？梢酝ㄟ^標(biāo)記一抗或二抗的手段引入HRP，一般采用市售的HRP二抗交聯(lián)物。仔細(xì)地淋洗對于降低背景非常重要，在與HRP交聯(lián)物溫育后，膜片更需仔細(xì)洗滌，所有步驟均在室溫下完成。

2. 化學(xué)發(fā)光試劑的配置在使用前等量混合a液和b液，混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。

3.蛋白信號顯現(xiàn)

1). 用平頭鑷鉗住膜片，垂直置于吸水紙以吸去過量試劑。

2). 置膜片于二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡。

3). 將膜片吸附蛋白面朝上，置于x光片盒中。

4). 于暗室中壓上x光片。

5).根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達(dá)最佳效果。顯影沖洗。

6). 調(diào)節(jié)曝光時間，再次曝光顯影。

4、膜的重復(fù)使用：

配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液，膜放入后，70?c振蕩水浴30分鐘。再用tbst或pbst緩沖液洗脫，最后用bsa（牛血清白蛋白）或牛奶封閉。

操作注意：

1. 試劑每個批號均獨(dú)立優(yōu)化，請不要混用或稀釋試劑以免降低敏感性；

2. 加入一抗后膜不能再干燥；

3. 適當(dāng)?shù)胤忾]和洗滌膜片至關(guān)重要；

4. 使用前配置化學(xué)發(fā)光試劑，配置足夠覆蓋膜片即可，棄去使用過的混合試劑；

5. 使用干凈取樣頭取用每種試劑；

6. 第一張片子建議曝光1分鐘，觀察結(jié)果后判斷最佳曝光時間可從30秒至2小時不等；

7. 除了放射自顯影片曝光和洗片處理外，所有步驟均不必在暗室中操作；

8. 膜片可經(jīng)適當(dāng)方法洗脫原有抗體，再次印跡使用，在此情況下，此試劑更為理想；

9. 因為它不象生色物質(zhì)需要從膜片上清除底物。

10. nan3能抑制HRP活性，應(yīng)避免使用nan3。

安全性：無特殊毒性，按普通化學(xué)品處理。如果不慎與眼、皮膚和衣物接觸，請立刻用大量清水沖洗。

儲存：2-8℃密封避光保存一年。

化學(xué)發(fā)光試劑ECL

ECL在化學(xué)領(lǐng)域，是一種化學(xué)發(fā)光試劑。electrochemiluminescence

化學(xué)發(fā)光試劑，一般是WesternBlot的最后一步，加入1：1的溶液A和溶液B，覆蓋pvdf膜，可以顯色來觀察實驗結(jié)果。

原理：一般使用的發(fā)光液A和B分別是魯米諾和過氧化氫，在辣根過氧化物酶（HRP）的催化作用下，魯米諾與過氧化氫反應(yīng)生成一種過氧化物，過氧化物不穩(wěn)定隨即分解，形成一種能發(fā)光的電子激發(fā)中間體，當(dāng)后者由激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)，就會產(chǎn)生熒光。

在發(fā)光過程中不需要消耗HRP,HRP只是起催化作用，所以只要HRP沒降解失活，是可以重復(fù)加發(fā)光液的。但HRP作為一種蛋白酶，在室溫放置時間過長，是會降解的；同時在發(fā)光過程中有什么物質(zhì)（比如顯影液）污染了膜的話,也有可能滅活膜上的HRP。

化學(xué)發(fā)光試劑魯米諾

HRP 標(biāo)記的CLEIA常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲酰肼,lum ino l) ,或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲酰肼) , 是一類重要的發(fā)光試劑。其結(jié)構(gòu)如圖4 所示。魯米諾的氧化反應(yīng)在堿性緩沖液中進(jìn)行,在過氧化物酶及活性氧[ 過氧化陰離子(O 2- ) , 單線態(tài)氧(1O 2 ) , 羥自由基(OH·) , 過氧化氫(H2O 2)]存在下,生成激發(fā)態(tài)中間體, 當(dāng)其回到基態(tài)時發(fā)光, 其波長為425nm。

早期用魯米諾直接標(biāo)記抗原(或抗體) ,但標(biāo)記后發(fā)光強(qiáng)度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標(biāo)記抗體, 進(jìn)行免疫反應(yīng)后利用魯米諾作為發(fā)光底物, 在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑(NaOH2H2O 2) 作用下, 魯米諾發(fā)光, 發(fā)光強(qiáng)度依賴于酶免疫反應(yīng)物中酶的濃度。Kodak Am erliteTM半自動分析系統(tǒng)就是利用這一體系專門設(shè)計的。

化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)發(fā)光酶

增強(qiáng)發(fā)光酶免疫分析(enhanced luminescence enzyme immunoassay, ELEIA )在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強(qiáng)發(fā)光劑, 如對2碘苯酚等, 以增強(qiáng)發(fā)光信號,并在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定, 便于重復(fù)測量, 從而提高分析靈敏度和準(zhǔn)確性。在全自動分析儀上, 還可通過計算機(jī)嚴(yán)密控制, 進(jìn)行自動操作, 如加試劑,混合, 溫育, 洗滌, 加發(fā)光試劑, 發(fā)光計數(shù), 數(shù)據(jù)處理, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 直至完成病人血清樣品的分析并打印出結(jié)果。Am erliteTM發(fā)光增強(qiáng)酶免分析系統(tǒng)用熒光素、噻唑等增強(qiáng)劑, 其發(fā)光時間可持續(xù)長達(dá)20m in, 試劑盒有甲狀腺功能檢測的促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結(jié)合球蛋白、游離甲狀腺素, 與性激素有關(guān)的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。

ALP標(biāo)記的CLEIA所用底物為環(huán)1, 22二氧乙烷衍生物, 這是一類很有前途的發(fā)光底物 ,用于化學(xué)發(fā)光酶免分析底物而設(shè)計的分子結(jié)構(gòu)中包含起穩(wěn)定作用的基團(tuán)——金剛烷基, 其分子中發(fā)光基團(tuán)為芳香基團(tuán)和酶作用的基團(tuán),在酶及起動發(fā)光試劑作用下引起化學(xué)發(fā)光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 spiroadam an2tane ) 42methoxy242( 3’2 phosphoryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名為: 32(2’2螺金剛烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22環(huán)二氧乙烷)。在堿性磷酸酶(AL P) 作用下,磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個磷酸基, 得到一個中等穩(wěn)定的中間體AM PD (半壽期為2～ 30m in) ,此中間體經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子, 當(dāng)其回到基態(tài)時產(chǎn)生470nm 的光,可持續(xù)幾十分鐘。AM PPD 為磷酸酯酶的直接化學(xué)發(fā)光底物,可用來檢測堿性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結(jié)合物。可檢測到堿性磷酸酯酶的濃度為10- 15mol/L 。