9002-07-7/胰蛋白酶的制備方法報道

背景及概述^[1]

胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近（23300），其等電點約為pH10.8，最適pH7.6～8.0，在pH=3時最穩(wěn)定，低于此pH時，胰蛋白酶易變性，在pH>5時易自溶；Ca²⁺離子對胰蛋白酶有穩(wěn)定作用。

胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對堿性氨基酸一端的選擇。

胰蛋白酶作為蛋白酶的一種，不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。

此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等。還可用于治療毒蛇咬傷，也常用于動物細胞培養(yǎng)前對組織的處理。

制備^[2]

1、胰蛋白酶粗制生產(chǎn)操作：

1.提取工序：

1.1新鮮的胰臟，用鑷子和剪刀將脂肪結(jié)締組織等除去，置絞碎機中絞碎，稱重15Kg；

1.2絞碎物置塑料桶中，用0.125mol/L硫酸溶液30L浸漬24小時，在浸漬期中每小時攪拌1次；

1.3將浸漬物置濾袋過濾，濾渣再用0.125mol/L硫酸溶液15L浸漬1小時，濾干后棄去濾渣；

2.鹽溶、鹽析工序：

2.1將兩次浸漬液合并，體積為44.9L，置塑料桶中，每1000ml溶液中加入固體硫酸銨242g，達到40%飽和度，共加10.866Kg固體硫酸銨，靜置12小時；

2.2過濾，留取過濾液，濾液體積為44L，固體棄去；

2.3在每1000ml清液中加入固體硫酸銨205g，達到70%飽和度，共用硫酸銨9.020kg，靜置12小時；

2.4過濾，留取濾餅，稱重269.2g，棄濾液；

2.5用807.6ml水溶解，再按2.1、2.2、2.3、2.4步驟分次加固體硫酸銨近40%和70%飽和度沉淀；

2.6取70%飽和度沉淀物，稱重178.5g，用267.8ml水溶解，加入89.3ml飽和硫酸銨溶液，并用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5.00；

2.7將溶液靜置25℃恒溫箱中48小時，有針狀的糜蛋白酶粗品結(jié)晶析出；

2.8過濾，母液用0.25mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至3.0，其體積為328.4ml加入硫酸銨100.8g，靜置12小時；

3.干燥工序：

取沉淀物，置真空干燥箱內(nèi)干燥，即得胰蛋白酶粗品，稱重100.0g，即每千克胰臟可得6.67克胰蛋白酶.

2、胰蛋白酶精制生產(chǎn)操作：

1.投料

1.1稱取胰蛋白酶粗品100.0g，先用300ml純化水?dāng)嚢枞芙?，?.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.0，以助其溶解，攪拌12小時；

1.2計量溶液體積298.4ml，加入固體硫酸銨140.9g，待其溶解后，靜置沉淀12小時；

1.3將溶液真空過濾，稱量濾餅重量96.6g，加純化水289.9ml，攪拌溶解后加2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.0，加入飽和硫酸銨溶液193.2ml，靜止沉淀12小時；

1.4將溶液過濾，量取濾液體積479.3ml，加入飽和硫酸銨溶液479.3ml，靜置沉淀12小時；

1.5洗鎂：將上清液棄去，沉淀物真空抽濾，并在濾餅上加入飽和硫酸鎂溶液，靜置1分鐘，抽濾，待濾液開始流出，將漏斗上剩余的硫酸鎂溶液傾去，將濾餅取出稱重93.3g，待活化；

2.活化

將濾餅溶于373.2ml0.005mol/L鹽酸溶液，另加入1mol/L氯化鈣溶液186.6ml及pH8.0硼酸緩沖液466.5ml，再加入746.4ml純化水，調(diào)節(jié)pH至7.4，最后加933mg活力較高的結(jié)晶胰蛋白酶進行活化處理，將溶液在5～10℃中靜置72小時進行活化，第二天測pH值為7.4；

3.除鈣

活化后的溶液用2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至3.1，溶液體積為1873ml，再加入固體硫酸銨455.2g，攪拌溶解，在0～10℃中存放48小時使硫酸鈣沉淀，過濾，濾液加入固體硫酸銨369.0g，在 0～10℃靜置12小時，過濾，得濾餅重量45.6g；

4.結(jié)晶

濾餅加入pH9.0硼酸緩沖液68.4ml，用2.5mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，攪拌均勻，再將溶液裝透析袋，5～10℃浸于外透液中，結(jié)晶5天，每2小時搖包一次；

5.透析

取出結(jié)晶液過濾得結(jié)晶物28.7g，加純化水43.1ml溶解，用2.5mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至3.0；將溶液裝透析袋，然后掛于透析池中透析3天，去除鹽類雜質(zhì)，每12小時左右透析池換水一次，溫度控制在5～10℃；

6.凍干

取出透析液，加入少量硅藻土，用布氏漏斗抽濾，得濾液，用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，進凍干機凍干后得結(jié)晶胰蛋白酶成品6.2g，經(jīng)測定其活性效價為2600iu/mg；

參考文獻

[1] [中國發(fā)明] CN201410819332.2 一種分離純化胰蛋白酶的方法及含有胰蛋白酶的藥物組合物

[2] [中國發(fā)明] CN201410819906.6 一種胰蛋白酶的制備方法及含有胰蛋白酶的藥物組合物