手機掃碼訪問本站
微信咨詢
凝血酶是一種使纖維蛋白原水解成為纖維蛋白的蛋白酶。凝血酶存在于動物血液中，通常以無活性的酶原形式存在。當(dāng)組織受傷或血管有病變時，細胞及血小板釋放凝血酶原激酶，使凝血酶原變?yōu)橛谢钚缘哪浮?主要生理功能是參與血液凝固。在血液中，凝血酶使可溶性的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性的纖維蛋白，而血纖維蛋白經(jīng)Ca2+和轉(zhuǎn)酰酰胺酶作用即凝結(jié)成塊，此即血液凝固。這種情況發(fā)生于組織創(chuàng)傷時，有止血作用;發(fā)生于血管病變時，易形成血栓。血栓在腦血管中則稱腦血栓，可導(dǎo)致癱瘓;血栓在冠狀動脈中導(dǎo)致部分心肌壞死(心肌梗死)。凝血酶還有刺激細胞增殖、誘導(dǎo)釋放纖溶酶原激活物，促進溶解血栓作用以及促進脂蛋白代謝多種生理功能。
凝血酶(Thrombin,EC3.4.21.5)是血漿凝血系統(tǒng)中的一種具有高度特異性的絲氨酸蛋白水解酶，可作為局部止血藥，是凝血酶凍干粉的主要原料。凝血 酶可以水解纖維蛋白原生成纖維蛋白單體，促使血小板分泌和聚集，因此，凝血酶在血液凝固和止血過程中發(fā)揮著重要的作用。
在臨床上，凝血酶廣泛應(yīng)用 于局部止血，可用于手術(shù)中不易結(jié)扎的小血管止血，消化道出血以及外傷出血等。凝血酶能識別LeuValProArg↓GlySer氨基酸序列，因此凝血酶在基因工程 中所得到的融合蛋白產(chǎn)品的后序加工處理過程中具有獨特的作用，為達到子目 的，必須使用限制性的凝血酶?，F(xiàn)有技術(shù)制備方法一般包括三個基本步驟，即提取、純化和凍干(或制劑)。
公開號為CN1844380A的發(fā)明專利提出了一種制備高純度凝血酶的方法，該方法利用層析介質(zhì)吸附低純度凝血酶溶液，對層析 柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，再經(jīng)凝膠層析，超濾脫鹽濃縮，最后凍干得 限制性凝血酶成品。該專利申請涉及到利用凝膠層析，不容易實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)， 且僅用到比活一個參數(shù)，不足以說明凝血酶的純度。
一種純度高、比活高的限制性凝血酶的制備方法。包括如下步驟：
步驟1、向新鮮豬血中加入抗凝劑，離心分離，取上清抗凝血漿；
步驟2、將上清抗凝血漿用陰離子交換柱層析，然后用洗脫劑Ⅰ對陰離子交 換柱進行洗脫，所得洗脫液即為凝血酶原溶液；
步驟3、活化凝血酶原溶液中的凝血酶原，得凝血酶粗溶液；
步驟4、將凝血酶粗溶液進行超濾濃縮，得凝血酶濃縮液；
步驟5、將所得的凝血酶濃縮液用陽離子交換柱層析，然后用洗脫劑Ⅱ?qū)﹃?離子交換柱進行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，得初步純化的凝血酶溶液；
步驟6、將步驟5所得凝血酶溶液用平衡液進行透析；
步驟7、將步驟6所得凝血酶溶液用陽離子交換柱層析，然后用洗脫劑Ⅲ對 陽離子交換柱進行洗脫，所得洗脫液即為限制性凝血酶溶液；
步驟8、將限制性凝血酶溶液進行超濾脫鹽濃縮，得限制性凝血酶濃縮液；
步驟9、將限制性凝血酶濃縮液凍干，即得白色粉末狀限制性凝血酶成品。
本發(fā)明的有益效果在于：利用豬血制備限制性凝血酶，有利于充分利用豬 血資源，減少環(huán)境污染；在常溫常壓下即可制備限制性凝血酶，減少設(shè)備投資； 制備得到的限制性凝血酶純度高，可達到電泳純，可用于酶切GST融合蛋白； 操作簡單，僅需離心、上樣層析、超濾和凍干等幾個步驟，容易實現(xiàn)工業(yè)化生 產(chǎn)。
一種從豬血中提取凝血酶的方法，包括如下步驟：
(1)往豬血中加入檸檬酸三鈉溶液，將混合液離心至分層后收集上清液，上清液用雙層脫脂紗布過濾后得上清抗凝血漿；
(2)將步驟(1)所得的上清抗凝血漿用A-50層析柱進行層析，上清抗凝血漿中的凝血酶原被吸附于A-50層析柱上，用氯化鈉溶液Ⅰ洗滌A-50層析柱，隨后用氯化鈉-氯化鈣混合溶 液洗脫并激活吸附于A-50層析柱上的凝血酶，得到凝血酶粗提液；
(3)將步驟(2)所得的凝血酶粗提液用樹脂層析柱進行層析，凝血酶粗提液中的凝血酶被吸附于樹脂層析柱上，用氯化鈉溶液Ⅱ洗脫吸附于樹脂層析柱上的凝血酶，得到凝血酶精提液；
(4)將步驟(3)所得的凝血酶精提液去除病毒后進行脫鹽濃縮，得凝血酶濃縮液；
(5)將步驟(4)所得的凝血酶濃縮液凍干，即得白色的粉狀凝血酶成品。
[1] 獸醫(yī)大辭典
[2] 科學(xué)技術(shù)社會辭典·生物
[3] CN201610107662.8 限制性凝血酶的制備方法
[4] CN201711147689.0 一種從豬血中提取凝血酶的方法