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己糖激酶(Hexokinase)是生物體呼吸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，具有催化己糖磷酸化的作用。己糖激酶存在于所有細(xì)胞中，是細(xì)胞產(chǎn)生能量所需要的一種酶，共有 5 種亞型，其中 I 和 II 分布在線粒體外膜，與電壓依賴性陽(yáng)離子通道蛋白結(jié)合;這種部位讓己糖激酶能直接獲得線粒體產(chǎn)生的 ATP，ATP是己糖激酶的底物之一。研究證明，己糖激酶在固有免疫系統(tǒng)中發(fā)揮模式識(shí)別受體功能，類似免疫系統(tǒng)的守門人角色，具有重要的功能。這種機(jī)制不僅在動(dòng)物細(xì)胞存在，在人體細(xì)胞內(nèi)同樣存在。因此，己糖激酶常被用作監(jiān)測(cè)人體健康狀況的指標(biāo)，目前己糖激酶已應(yīng)用于血糖檢測(cè)試劑盒中，利用己糖激酶法測(cè)定血糖含量是國(guó)際上推薦的葡萄糖測(cè)定方法，但因己糖激酶是小酶種，中國(guó)研究領(lǐng)域?qū)ζ潢P(guān)注度不高，市場(chǎng)上的己糖激酶制劑均為進(jìn)口產(chǎn)品，故血糖檢測(cè)試劑盒價(jià)格相對(duì)較高?，F(xiàn)提供了一種制備己糖激酶干粉的方法，并對(duì)所制得的干粉進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究，為降低己糖激酶血糖檢測(cè)試劑盒的成本提供了理論依據(jù)。
菌種的制備[1]：將凍存管的菌種BW25113-pYBE／sc己糖激酶活化后，以1％接種量接種于含有50μg／mL璉霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于37℃，180 r／min的條件下培養(yǎng)8 h。
基礎(chǔ)發(fā)酵工：將上述培養(yǎng)的種子液以2％接種量轉(zhuǎn)接到100 mL／500mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于37℃、180 r／min的條件下培養(yǎng)至1．5 h后加入1 mL 20％的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，之后在相同條件下培養(yǎng)14 h。
菌體的破壁工藝：將上述培養(yǎng)的發(fā)酵液在4℃，10 000 r／min條件下離心10 rain收集菌體細(xì)胞，并用50 mmol／L、pH 7．6的TEA-HCL緩沖液溶解于50 mL離心管，在冰浴條件下，選用6 mm變幅桿、200 W的功率進(jìn)行細(xì)胞破碎，破壁期間超聲波工作1．5 S間歇1s，設(shè)1，2，3，4，5，6，7，8min 8個(gè)破壁總時(shí)長(zhǎng)，破壁后分別對(duì)破壁菌體進(jìn)行顯微觀察，以破碎菌體數(shù)對(duì)菌體總數(shù)的比值來(lái)計(jì)算破壁率，并對(duì)離心后收集的上清液進(jìn)行酶活性測(cè)定，綜合破壁率和酶活力指標(biāo)確定最優(yōu)破壁時(shí)長(zhǎng)。
己糖激酶的純化工藝：重組己糖激酶采用鎳柱親和層析法進(jìn)行純化。將獲得的己糖激酶上清液利用pH 8．0含50 mmol／L NaH2PO。、2mmol／L咪唑、0．3 mol／L NaCl的洗滌液對(duì)雜蛋白進(jìn)行洗脫，之后利用pH 8．0含50 mmol／L的NaH2PO4、50 mmol／L咪唑、0．3 mol／L的NaCl的洗脫液對(duì)目的蛋白進(jìn)行洗脫，收集洗脫液后用SDS-PAGE進(jìn)行分析。
酶活性測(cè)定方法：將收集的己糖激酶粗酶液活力進(jìn)行測(cè)定。分別添加1 mL濃度為0．05mol／L的TEA-HCL，1 mL濃度為0．555 mol／L的肛葡萄糖，0．1 mL濃度為0．019 mol／L的ATP，0．2mL濃度為0．1 mol／L的MgCl2，0．2 mL濃度為0．014 mol／L的NADP+，0．02 mL濃度為125U／mL的葡萄糖一6一磷酸脫氫酶到試驗(yàn)管和空白管，混勻后于25℃水浴1 min，于340 nm處讀取吸光值A(chǔ)1。然后試驗(yàn)管加入0．05 mL待測(cè)酶液，空白管加入0．05 mL的ddH20，于25℃繼續(xù)反應(yīng)5 min，后讀取吸光值A(chǔ)2。酶活力計(jì)算公式如下圖：（式中，2．57為反應(yīng)液總體積，Df為稀釋倍數(shù)，6．22為p-NADPH在340nm處的吸光系數(shù)，0．05為比色皿體積。）
圖1 酶活力計(jì)算公式
凍干工藝：通過(guò)對(duì)制得的己糖激酶干粉進(jìn)行研究，初步確定己糖激酶酶學(xué)性質(zhì)。己糖激酶的最適溫度為 50 ℃，熱穩(wěn)定性試驗(yàn)表明己糖激酶具有一定的耐熱性。此外，己糖激酶最適 pH 在 8. 0 左右，說(shuō)明該己糖激酶較適于中性偏堿的條件，在 pH7. 0 ～9. 0 之間比較穩(wěn)定，處理 20 h后仍有較高的活性，為己糖激酶應(yīng)用于血糖檢測(cè)試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
超聲波破壁提取己糖激酶粗酶液常見(jiàn)的微生物菌體破壁提取胞內(nèi)酶的方法有超聲破碎、酶溶法、高壓勻漿法等。通過(guò)對(duì)比溶菌酶、溶壁酶、超聲破碎提取菌株BW25113-pYBE／sc己糖激酶發(fā)酵生產(chǎn)的己糖激酶發(fā)現(xiàn)，酶溶法可以破碎大腸桿菌細(xì)胞壁，但最終檢測(cè)酶活性指標(biāo)異常偏低，推測(cè)溶菌酶與溶壁酶可能會(huì)影響己糖激酶的活性。本研究采取超聲波破壁方法提取胞內(nèi)酶己糖激酶，超聲破壁對(duì)胞內(nèi)酶的提取影響比較復(fù)雜，超聲時(shí)間短菌體破壁不充分，胞內(nèi)酶不能充分釋放；超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)對(duì)酶的構(gòu)象產(chǎn)生影響，進(jìn)而改變酶的活性。本試驗(yàn)超聲波破壁結(jié)果所示，5～8分鐘的破壁率均能達(dá)到100％，菌體破壁充分，但5分鐘以上的破壁總時(shí)長(zhǎng)會(huì)降低酶活性，故最終選擇破壁總時(shí)間為5分鐘。
超聲波破壁后得到粗酶液，用鎳柱親和層析法進(jìn)行純化，其中CL為破壁后的粗酶液條帶，經(jīng)過(guò)純化工藝后獲得單一的蛋白條帶(E3)，分子量大小為60 kD，經(jīng)測(cè)定表現(xiàn)為己糖激酶活性，粗酶液經(jīng)純化后獲得純度較高的己糖激酶。
己糖激酶法測(cè)定人體血糖具有特異性高、抗干擾能力強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的優(yōu)點(diǎn)，是臨床檢驗(yàn)中輔助醫(yī)生精確診斷病人血糖水平的最佳方法，也是WHO推薦的測(cè)定血糖的參考性方法。但國(guó)內(nèi)沒(méi)有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的己糖激酶產(chǎn)品，血糖試劑中的己糖激酶依賴進(jìn)口，導(dǎo)致己糖激酶法血糖試劑盒價(jià)格昂貴，限制了己糖激酶法在血糖測(cè)定中的推廣應(yīng)用。
[1] 劉春卯，羅同陽(yáng)，胡美榮，等． 診斷試劑用己糖激酶的制備工藝研究［J］． 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40(1): 66-70