9000-90-2 / alpha-淀粉酶的制備方法

背景及概述^[1]

alpha-淀粉酶即α-淀粉酶，廣泛存在于生物界。alpha-淀粉酶能夠催化隨機(jī)水解淀粉的 α?1，4?糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖、麥芽三糖和α糊精。alpha-淀粉酶廣泛應(yīng)用于飴糖、啤酒、黃酒、葡萄糖、酒精、白酒、味精和醫(yī)藥等行業(yè)。

制備^[1]

（1）載體pxmj19-aph213的制備。

載體pxmj19-aph213的構(gòu)建過(guò)程如下：

以引物aph213F和aph213R從載體xk99e載體上擴(kuò)增出aph213基因，所用的引物如下：

aph213F：ccggatatcagcttcacgctgccgcaagcac

aph213R：ccgaagcttaattctgtttcctgtgtgaaattg

PCR條件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。

上述引物的設(shè)計(jì)使得aph213基因擴(kuò)增過(guò)程中，在aph213基因上游形成EcoRV切點(diǎn)、下游形成HindIII 切點(diǎn)，aph213的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；回收PCR產(chǎn)物并以EcoRV和HindIII酶切，通過(guò)T4DNA連接酶，連接到同樣經(jīng)過(guò)EcoRV和HindIII酶切的載體pxmj-19上，獲得載體pxmj19-aph213。

載體pxmj19-aph213的擴(kuò)增過(guò)程如下：

a、在50ml離心管中加入3ml的LB培養(yǎng)基，加入1.5ul的34mg/ml的氯霉素抗生素；

b、挑取帶有載體pxmj19-aph213的大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)接至上述培養(yǎng)基中，在37℃，230rpm的條件下培養(yǎng)12h，以擴(kuò)增pxmj19-aph213質(zhì)粒；

c、根據(jù)質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書提取pxmj19-aph213質(zhì)粒。

（2）枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因的擴(kuò)增與改造。

以引物AmyF和AmyR從枯草芽孢桿菌的基因組上擴(kuò)增出α-淀粉酶基因，所用的引物如下：

AmyR：ccgctcgagtcagtggtggtggtggtggtgatggggaagagaaccgcttaag；

AmyF：ccgaagcttgaaaggaggacctaatgtttgcaaaacgattcaaaacc；

PCR條件如下：95℃ 4min；95℃ 30s、62℃ 30s、72℃ 2min，35個(gè)循環(huán)；72℃7min。

上述引物的設(shè)計(jì)使得α-淀粉酶基因擴(kuò)增過(guò)程中，在α-淀粉酶基因上游形成e3 SD序列、下游形成組氨酸標(biāo)簽，上游酶切位點(diǎn)為HindIII，下游酶切位點(diǎn)為XhoI；

（3）構(gòu)建重組載體。

回收PCR產(chǎn)物并用XhoI和HindIII酶切，通過(guò)T4DNA連接酶，連接到同樣經(jīng)過(guò)XhoI和HindIII酶切的載體pxmj19-aph213上，獲得重組表達(dá)載體pxmj19-aph213-amy。

（4）構(gòu)建重組菌。

將重組表達(dá)載體pxmj19-aph213-amy轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，氯霉素濃度為50ug/ml；提取后，用電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌中，在LBHIS恢復(fù)培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，氯霉素濃度為30ug/ml。

（5）培養(yǎng)重組菌，分泌表達(dá)α-淀粉酶。

將長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到裝有50ml培養(yǎng)基的250ml的三角瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為BHI培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為30℃，230rpm，48h。

（6）α-淀粉酶的純化。

a、將重組菌的培養(yǎng)物進(jìn)行離心，12000rpm、4℃、5min，獲得含有α-淀粉酶的上清。

b、將含有α-淀粉酶的上清進(jìn)行親和層析，首先用緩沖液A平衡鎳柱，將含有α-淀粉酶的上清過(guò)濾并上樣至平衡后的鎳柱，繼續(xù)用緩沖液A平衡至基線水平后繼續(xù)平衡3個(gè)柱體積；用100mmol的B液洗脫，收集洗脫的洗脫液，每管收集0.5ml；

緩沖液A為：300mM NaCl，20mM Tris，pH8.0的緩沖液，緩沖液B為：300mM NaCl，250mM 咪唑，20mM Tris，pH8.0的緩沖液。

c、對(duì)含有α-淀粉酶的洗脫液通過(guò)脫鹽柱進(jìn)行脫鹽，獲得純化的α-淀粉酶溶液，-20℃保存；

脫鹽用的緩沖液為50mM的PBS緩沖液，pH為7.0。

參考文獻(xiàn)

[1] [中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)] CN201610836135.0 α-淀粉酶的制備方法【公開】/α-淀粉酶的制備方法【授權(quán)】