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克里唑替尼（亦翻譯為：克唑替尼）是FDA批準(zhǔn)的首個(gè)非小細(xì)胞肺癌精準(zhǔn)藥物，也是腫瘤藥物研發(fā)史上開(kāi)發(fā)最快的四大傳奇藥物之一。2006年，克里唑替尼被發(fā)現(xiàn)對(duì)攜帶EML4-ALK融合基因表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，并開(kāi)始I期臨床試驗(yàn)，2011年克里唑替尼通過(guò)快速通道被FDA批準(zhǔn)上市，并引發(fā)轟動(dòng)，主導(dǎo)發(fā)明人華裔女科學(xué)家崔景榮博士也因此榮獲第38屆美國(guó)國(guó)家發(fā)明者年度獎(jiǎng)，每年全美各行業(yè)中只有一個(gè)專利可獲此殊榮。
克里唑替尼的研發(fā)歷程既有偶然的成分也有必然的成分，偶然的是克里唑替尼本是基于c-Met激酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)的，卻對(duì)ALK激酶具有強(qiáng)效的抑制活性，而必然的是由苗頭化合物向先導(dǎo)化合物過(guò)度時(shí)是依據(jù)傳統(tǒng)的藥物化學(xué)和構(gòu)效關(guān)系為策略進(jìn)行的，同時(shí)利用復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行“量體裁衣”式的優(yōu)化，后期則用親親脂性效率對(duì)成藥性進(jìn)行全程“監(jiān)視”?！白兓媚獪y(cè)”卻“有的放矢”就是科學(xué)的魅力所在。
輝瑞研發(fā)的舒尼替尼于2006年上市，該藥對(duì)多種酪氨酸激酶均有較強(qiáng)的抑制活性，故可用于治療對(duì)伊馬替尼耐藥的胃腸道間質(zhì)瘤患者。循此研發(fā)路徑，輝瑞繼續(xù)著手研發(fā)與其他激酶有關(guān)的腫瘤藥物。間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子激酶 (c-Met) 也是受體酪氨酸激酶，其信號(hào)通路對(duì)發(fā)育、器官形成和機(jī)體穩(wěn)態(tài)起著重要作用，因此c-Met被認(rèn)為是腫瘤藥物治療的重要靶標(biāo)。
考慮到羥基吲哚的N-H和C=O結(jié)構(gòu)可與激酶通過(guò)氫鍵結(jié)合，故輝瑞對(duì)具有羥基吲哚結(jié)構(gòu)的化合物進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，衍生物1對(duì)c-Met激酶具有較強(qiáng)的抑制活性(IC50=10 nmol·L-1)，且在1μmol·L-1濃度下可因抑制c-Met而完全阻止A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，故認(rèn)為衍生物1具有較好的開(kāi)發(fā)潛能。
為了提高該衍生物對(duì)c-Met激酶的選擇性，研究人員分別在母核的4位或5位分別引入取代苯基和芐基磺?；鶄?cè)鏈，設(shè)計(jì)并合成了一系列衍生物。
對(duì)合成近千個(gè)化合物進(jìn)行活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，衍生物4對(duì)c-Met激酶具有較高的選擇性，強(qiáng)于對(duì)其他激酶抑制活性的50倍以上，且對(duì)c-Met激酶的抑制活性亦較高(IC50=9 nmol·L-1)；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，化合物4能抑制移植性腫瘤細(xì)胞的c-Met磷酸化，其活性參數(shù)測(cè)定結(jié)果為：配體效率LE=0.25、親脂性效率LipE=4.85、分布系數(shù)logD=3.20，故化合物4可作為候選化合物進(jìn)入開(kāi)發(fā)階段。
通過(guò)對(duì)化合物4與c-Met激酶的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)：(1) 結(jié)合域的 A-環(huán)套采取了獨(dú)特的自身抑制狀態(tài)的構(gòu)象，即在激酶的活化環(huán)套殘基1222～1227形成轉(zhuǎn)折，占據(jù)了αC螺旋的催化位置，使得1228～1245環(huán)套殘基移位，干擾了ATP 與底物的結(jié)合；(2) 吲哚酮的N-H和C=O基團(tuán)與激酶的殘基分別形成氫鍵；(3) 吲哚酮的C=O與吡咯環(huán)的N-H形成分子內(nèi)氫鍵，因而吲哚酮與吡咯環(huán)形成較大的共軛平面，處于ATP的腺嘌呤環(huán)結(jié)合的平面裂隙處；(4) 連接羥基吲哚與二氯苯基的連接基磺酰亞甲基形成U-形轉(zhuǎn)折，使二氯代芐基與具有獨(dú)特構(gòu)象的A-環(huán)套上Tyr1230的苯酚環(huán)發(fā)生π-π堆積作用；(5) 磺?；难踉优c Asp1222的N-H形成氫鍵，穩(wěn)定了分子取向；(6) 與吡咯環(huán)相連的酰胺及延伸的片段進(jìn)入了水相，未與蛋白結(jié)合。
從結(jié)合信息可知，二氯苯基為了可與Tyr-1230發(fā)生π-π堆積作用，磺酰亞甲基自行進(jìn)行U-形轉(zhuǎn)折，可能是由于二氯苯基、吲哚酮及吡咯環(huán)形成的共軛平面過(guò)大，故需縮小其基本骨架。基于骨架躍遷原理，首先將吲哚酮與吡咯的分子內(nèi)氫鍵“固化”成共價(jià)鍵，為氮雜吖啶5；隨后切斷C-N鍵形成2-氨基-3-苯基吡啶化合物6；最后進(jìn)一步簡(jiǎn)化連接基團(tuán)，得到衍生物7。
雖然衍生物7對(duì)c-Met激酶的抑制活性較弱Ki=3.83μmol·L-1，但是由于分子量比較低，其配體效率優(yōu)于5(LE=0.29)，但親脂性效率有所降低(LipE=0.35)。故可在衍生物苯環(huán)的羥基處引入極性側(cè)鏈，引入嗎啉亞乙基得到衍生物8，活性略有提高(Ki=2.45 μmol·L-1)，但是降低了配體率，隨后模仿衍生物4的片段，得到9，抑制活性和親脂性效率均有所提高，Ki=0.46μmol·L-1，LE=0.24，LipE=3.70。
為了考察環(huán)上取代基對(duì)活性Ki和親脂性效率LipE的影響，在苯環(huán)上引入一個(gè)或多個(gè)、相同或不同的鹵素，連接鏈或用甲基取代、或不取代，合成了一系列通式10的衍生物，活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，衍生物11的活性最高，對(duì)c-Met酶的活性參數(shù)為：Ki=0.012μmol·L-1、LipE=4.82；對(duì)c-Met細(xì)胞的活性參數(shù)為：IC50=0.020μmol·L-1、 LipE=4.60。
根據(jù)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，5-苯基結(jié)合于Tyr1159、Ile1084和Gly1163構(gòu)成的疏水性狹窄裂隙，這需要確保在氨基吡啶的5位連接的芳環(huán)具有平面性，芳基上連接的基團(tuán)延伸到溶劑相中。此外，11中的酰胺片段已離開(kāi)疏水裂隙，進(jìn)入水相，提示延伸的親水性片段可不必經(jīng)酰胺鍵連接。
用五元含氮芳環(huán)替換5-苯環(huán)可增加水溶性，例如含5-吡唑或咪唑化合物的 cLogD比相應(yīng)的苯化合物低2個(gè)單位，并且較小扭角，增加了共面性，有利于結(jié)合。氨基吡啶與吡唑環(huán)的連接方式對(duì)活性影響很大，例如化合物12和13的活性以及 LipE 值相差很大。結(jié)構(gòu)生物學(xué)表明，12的吡唑環(huán)氮原子所處的位置使得c-Met的殘基Met1160和Ile1084取向與吡唑環(huán)鄰近，不利于氨基吡啶的氫鍵結(jié)合，而且該吡唑環(huán)處于酶蛋白的疏水性界面，為了發(fā)生疏水-疏水相互作用，N原子的孤電子對(duì)的去水合作用是不利的焓變；而13的N原子都進(jìn)入了水相，沒(méi)有上述的不利效應(yīng)，因而活性高12，酶或細(xì)胞活性提高了30～40倍?；衔?3的N-甲基化后產(chǎn)14的活性更強(qiáng)，提示由這個(gè)N原子可引出含有極性基團(tuán)的碳鏈，以提高活性水溶性。
鑒于化合物9結(jié)構(gòu)中含有延伸到水相的堿性基團(tuán)能夠提高活性和親脂性效率，因而也在吡咯環(huán)系上引入盡可能小的堿性片段,例如鏈烷基，胺、氮雜環(huán)丁烷、四氫吡咯、哌啶等，以增加活性和改善藥學(xué)和藥代性質(zhì)。在選擇高活性和高親脂性效率的化合物同時(shí)，還評(píng)價(jià)對(duì)人肝微粒體的穩(wěn)定性，從有代表性的化合物中優(yōu)選出15和16，尤其是因16的高活性和較好的代謝穩(wěn)定性，確定為候選藥物。
前述優(yōu)化過(guò)程制備的吡唑系列化合物含有手性碳原子，都是用混旋的樣品測(cè)定活性的。將優(yōu)選出的化合物16拆分成光學(xué)活性物質(zhì)，活性測(cè)定表明，R-構(gòu)型的分17活性強(qiáng)于RS和S構(gòu)型，對(duì)酶和細(xì)胞抑制活性分別為Ki = 0.002μmol·L-1和IC50=0.008μmol·L-1，命名為克里唑替尼(crizotinib)。
克里唑替尼從2007年立項(xiàng)到2011年FDA批準(zhǔn)上市，僅用了4年時(shí)間，它的出現(xiàn)是個(gè)體化治療的又一重大突破，其在臨床上的地位超越了常規(guī)化療，是當(dāng)前ALK 陽(yáng)性的晚期非小細(xì)胞肺癌患者標(biāo)準(zhǔn)藥物。
1 Cui JR, et al. 4-Aryl substituted indolinones. WO02/055517
2 Cui JR, et al. 5-Aralkylsulfonyl-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinones as kinaseinhibitors. WO 02/096361
3 Cui JR, Tran DM, Shen H, et al. Structurebased drug design of crizotinib (PF-02341066), a potent and selective dualinhibitor of mesenchymal-epithelial transition factor (c-MET) kinase andanaplastic lymphoma kinase (ALK). J Med Chem, 2011, 54: 6342-6363
4 Roberts PJ. Clinical use of crizotinib for thetreatment of non-small cell lung cancer. Biologics, 2013, 7: 91–101.