872728-81-9 / 甲磺酸達比加群酯的制備方法和有關物質檢測

背景及概述^[1]

甲磺酸達比加群酯是應用于臨床的直接凝血酶抑制劑，是一種新型口服抗凝藥。其作用機理是通過可逆性強效競爭結合凝血酶的纖維蛋白特異結合位點，使纖維蛋白生成受阻，從而抑制血栓的形成。甲磺酸達比加群酯是達比加群的前體藥物，在體內(nèi)代謝后轉化為具有活性的達比加群。與華法林相比，甲磺酸達比加群酯在治療過程中無需頻繁監(jiān)測凝血功能和調(diào)整給藥劑量，藥物之間相互作用少，不受進食影響，從而提高了患者的用藥依從性。

有關物質檢測^[1]

強文舟等人參考國家食品藥品監(jiān)督管理局達比加群酯膠囊進口藥品注冊標準關于有關物質的規(guī)定，并結合收斂型原料藥合成工藝，共獲得9個已知雜質（A~I，結構見圖1），其中雜質A、B、C和D為合成工藝雜質，其余為降解雜質。建立了甲磺酸達比加群酯原料藥中有關物質HPLC檢測法，本方法適用性好試驗效率高，通過驗證表明此方法專屬性強且靈敏度高，能對甲磺酸達比加群酯中有關物質進行有效控制。

1儀器、樣品與試劑

1.1儀器

島津公司LC-2010AHT高效液相色譜儀，SPDM20A二極管陣列檢測器，LabSolution色譜工作站；百萬分之一天平（賽多利斯公司）。

1.2樣品與試劑

甲磺酸達比加群酯原料藥（批號140301、140302、140303）、甲磺酸達比加群酯對照品（純度≥99.5%，批號140204），西安新通藥物研究有限公司；對照品雜質A（純度≥98%，批號14011202）、雜質B（純度≥98%，批號14011902），上海百誼生物科技有限公司；對照品雜質C、雜質D為合成工藝中間體，純度均≥98%，西安新通藥物研究有限公司；對照品雜質E（純度≥99.5%，批號D01833）、雜質F（純度≥99.5%，批號D01835）、雜質G（純度≥99.5%，批號01836）、雜質H（純度≥99.5%，批號D01837）、雜質I（純度≥99.5%，批號D01834），深圳菲斯生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2方法與結果

2.1色譜條件

采用菲羅門PhenomenexC18（250mm×4.6mm，5µm）色譜柱，以pH4.5的醋酸銨緩沖液（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（程序見表1），流速1.0mL·min^-1，柱溫為40℃，檢測波長為242nm（檢測雜質B、D、G）、310nm（檢測雜質A、E、F、I）、340nm（檢測雜質C、H），進樣量10µL。

2.2系統(tǒng)適用性試驗

取雜質A~I的對照品各5mg，精密稱定，分別置25mL量瓶中，加30%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得各雜質的儲備液。取甲磺酸達比加群酯原料藥10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加30%乙腈約5mL溶解，再分別精密加入各雜質的儲備液100µL，加30%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得雜質定位混合溶液；進樣10µL，記錄色譜圖，見圖2。雜質A~I各峰之間的分離度均大于1.5，達比加群酯與相鄰雜質峰之間的分離度大于1.5。

2.3線性關系考察

分別取各雜質儲備液及甲磺酸達比加群酯對照品適量，加30%乙腈配制成1mL中含雜質A、B、C、D各1μg的混合溶液1，分別進樣6、8、10、12、15μL；1mL中含雜質E、F、G、H各2μg的混合溶液2，分別進樣3、10、15、20、30、40μL；1mL中含雜質I、達比加群酯各4μg的混合溶液3，分別進樣1、3、10、15、30、50、80μL。以進樣量（ng）為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程。同時計算各雜質相對于達比加群酯的校正因子。結果見表2。

2.4檢測下限和定量下限

稱取雜質A~I及甲磺酸達比加群酯的對照品適量，分別加30%乙腈配制成1mg·mL-1的儲備液，并稀釋制成系列濃度溶液，取10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以信噪比S/N≥3時的測定結果作為檢測限，信噪比S/N≥10時的測定結果作為定量限見表2。

2.5溶液穩(wěn)定性

取甲磺酸達比加群酯原料藥10mg，精密稱定，置10mL量瓶中，加30%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。該溶液在室溫（25℃）下和4~8℃分別放置，并于0、3、6、12h分別進樣測定，分別記錄242、310、340nm波長下的色譜圖。按照面積歸一化法計算含量。除了雜質A~I按確定的檢測波長進行檢測，未知雜質（以達比加群為參比，相對保留時間為1.16）選擇242、310、340nm3個波長中吸收最強的波長310nm計算含量。結果見表3。結果顯示，供試品溶液在室溫時，雜質E和雜質I增長明顯，6h時已經(jīng)增長翻倍，12h不再測定；在4~8℃時，12h內(nèi)比較穩(wěn)定。其他已知雜質均未檢出。

2.6專屬性試驗

2.6.1空白溶劑取溶劑（30%乙腈）10µL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果顯示溶劑對測定無干擾。

2.6.2強制降解取甲磺酸達比加群酯原料藥10mg，分別進行強酸降解（1mol·L^-1鹽酸1mL，室溫放置4h）、強堿降解（1mol·L^-1氫氧化鈉1mL，室溫振搖0.5h）、氧化降解（3%雙氧水，室溫放置4h）、光照降解（4500lx日光燈光，照射24h）、高溫降解（沸水加熱1h），酸、堿降解必須進行中和，即得各降解樣品。各降解樣品用30%乙腈制成1mg·mL^-1的降解樣品溶液，同時制備相同濃度的未破壞樣品的供試品溶液。取上述各溶液10µL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖3。在酸、堿降解條件下，主要降解得到雜質H，并且有一相對保留時間（以達比加群酯作參比）為0.9的主要降解雜質；在氧化、光照和高溫降解條件下，均會降解得到雜質E；在光照和高溫降解條件下，主要降解得到雜質E和雜質I。

2.7精密度和回收率試驗

取甲磺酸達比加群酯原料藥10mg，加30%乙腈5mL溶解，加入各雜質儲備液適量，用30%乙腈稀釋制成每1mL含雜質A~I及甲磺酸達比加群酯均約1μg的混合溶液，控溫4~8℃。取上述混合溶液10μL連續(xù)進6次，記錄色譜圖。在選定的波長下測定各雜質，以各雜質的峰面積計算精密度試驗的RSD。結果峰面積的RSD在0.19%~0.67%，滿足精密度要求RSD≤2.0%，表明此方法精密度良好。精密稱取甲磺酸達比加群酯原料藥10mg，置10mL量瓶中，加5mL30%乙腈溶解，加入各雜質儲備液適量，配制成各雜質質量濃度均分別為7.5、5和2.5μg·mL^-1（相當于甲磺酸達比加群酯濃度的0.75%、0.5%、0.25%）的溶液各3份，作為回收率試驗溶液，控溫4~8℃，分別進樣測定，計算得雜質A~I的回收率（n=9）分別為92.5%~94.5%［回收率平均值（n=3）分別為92.6%、94.2%、93.8%，RSD分別為0.14%、0.49%、0.53%］、93.4%~98.1%［回收率平均值（n=3）分別為95.4%、96.0%、94.7%，RSD分別為2.1%、2.5%、1.6%］、90.1%~97.2%［回收率平均值（n=3）分別為90.6%、95.9%、90.5%，RSD分別為0.64%、1.1%、0.67%］、92.8%~101.0%［回收率平均值（n=3）分別為94.5%、99.9%、99.3%，RSD分別為1.6%、1.1%、0.57%］、98.1%~100.7%［回收率品均值（n=3）分別為98.3%、100.4%、98.7%，RSD分別為0.21%、0.30%、0.21%］、99.8%~105.8%［回收率平均值（n=3）分別為100.1%、104.4%、105.6%，RSD分別為0.31%、0.37%、0.38%］、92.3%~97.5%［回收率平均值（n=3）分別為92.4%、94.4%、96.2%，RSD分別為0.14%、0.52%、1.2%］、95.9%~101.3%［回收率平均值（n=3）分別為96.5%、100.8%、98.1%，RSD分別為0.75%、0.50%、1.1%］和98.9%~103.8%［回收率平均值（n=3）分別為100.4%、102.6%、102.8%，RSD分別為1.7%、0.29%、1.6%］，RSD分別為0.89%、1.9%、3.0%、2.8%、0.99%、2.3%、1.9%、2.1%和1.6%。

2.8樣品測定

取3批甲磺酸達比加群酯原料藥，分別按“2.5”項下方法制備供試品溶液；精密量取供試品溶液1mL，置100mL量瓶中，加30%乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取5mL，置10mL量瓶中，加30%乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得對照溶液。取供試品溶液、對照溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。已知雜質按照加校正因子的自身對照法來進行計算各雜質含量，未知雜質按照主成分的自身對照法進行計算（供試品中任何小于對照溶液主峰面積1/20的未知雜質峰可忽略不計），結果見表4。

制備方法^[2]

甲磺酸達比加群酯的制備方法，其操作過程具體介紹如下：

（1）將3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對甲苯磺酸鹽、碳酸鉀加入溶解劑中混合均勻；

具體用量方面，3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對甲苯磺酸鹽用量為40g，碳酸鉀用量為56g；

混合操作時，所述溶解劑為丙酮-水體系；所述丙酮-水體系，具體由1000ml丙酮和550ml水混合均勻配制而成溶液。

所述3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對甲苯磺酸鹽，通過如下步驟制備獲得：

A、將3-[[[2-[[(4-氰基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基]羰基]吡啶-2-基氨基]丙酸乙酯、甲醇加入反應釜中；

具體用量方面，甲醇加入量為300g，3-[[[2-[[(4-氰基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基]羰基]吡啶-2-基氨基]丙酸乙酯用量為50g，即，甲醇加入量為3-[[[2-[[(4-氰基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基]羰基]吡啶-2-基氨基]丙酸乙酯質量的6倍；

B、通入氯化氫氣體至飽和，室溫反應24小時；

C、減壓蒸干后加入甲醇300g溶解，通入氨氣至飽和，室溫反應24h；

D、然后加入對甲苯磺酸，攪拌析晶，過濾、洗滌（采用丙酮進行洗滌）、干燥，即得3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對甲苯磺酸鹽；

具體用量方面，對甲苯磺酸用量為31g；

最終制得3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對甲苯磺酸鹽42.0g。

（2）向步驟（1）中混合均勻的反應體系中加入氯甲酸正己酯，常溫下（20℃左右）反應3h左右；然后4℃左右進行析晶，過濾得粗品；

對應步驟（1）中的用量，氯甲酸正己酯用量為11g。

（3）將步驟（2）所得粗品加精制溶劑乙醇300ml 于60℃左右溶解，溶解完全后，將反應液降溫至4℃左右進行析晶，過濾，得達比加群酯25.0g。

（4）將步驟（3）所得達比加群酯20.0g加反應溶劑丙酮200ml 于42℃左右溶解，溶解完全后滴加甲磺酸3.2g，充分反應后將反應液降溫至4℃左右析晶，過濾，將濾餅干燥7～8h，所得即為甲磺酸達比加群酯，共獲得21.4g。

進一步對所獲得成品進行檢測，最終計算及檢測結果表明：以3-[[[2-[[(4-脒基苯基)氨基]甲基]-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-羰基](吡啶-2-基)氨基]-丙酸乙酯對甲苯磺酸鹽計，重量收率為 66.9%；而高效液相色譜法（HPLC）測定純度為：99.8%，最大單雜0.08%。

參考文獻

[1]強文舟,張艷俠,傅強.HPLC法測定甲磺酸達比加群酯的有關物質[J].藥物分析雜志,2020,40(04):672-680.

[2] [中國發(fā)明] CN201810729075.1 一種甲磺酸達比加群酯的制備方法