72-18-4 / 生物素對L-纈氨酸發(fā)酵的影響

L-纈氨酸是人體所必需的8種氨基酸之一，在人體內(nèi)有特殊的生理功能，是維持人生命活動的重要物質(zhì)。微生物發(fā)酵法逐漸成為世界范圍內(nèi)生產(chǎn)L-纈氨酸的主要方式，而發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸的成本則主要受到發(fā)酵水平高低的影響。目前，L-纈氨酸主要利用經(jīng)代謝工程手段改造之后的谷氨酸棒狀桿菌進行發(fā)酵生產(chǎn)，而這種方法目前主要面臨糖酸轉(zhuǎn)化率不高、主產(chǎn)物積累造成反饋抑制以及副產(chǎn)物丙氨酸中后期積累過多影響最終L-纈氨酸提取的問題。

生物素又稱VH、VB7和輔酶R，以多種方式參與谷氨酸棒狀桿菌的生長代謝。生物素是整個生物界生長發(fā)育所必需的元素，在使用谷氨酸棒狀桿菌作為生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸時，生物素添加量直接影響生產(chǎn)菌的生長、增殖和代謝速率，并決定細胞轉(zhuǎn)型的時間及細胞膜的通透性，添加適量的生物素能夠使產(chǎn)酸高峰期提前，延長產(chǎn)酸周期，從而提高L-纈氨酸的產(chǎn)率，因此，確定一個合適的生物素添加量是提高L-纈氨酸產(chǎn)率的有效手段。

1 生物素添加量對菌體生長及L-纈氨酸產(chǎn)率的影響

經(jīng)過14 h的種子培養(yǎng)及52 h的發(fā)酵培養(yǎng)，隨生物素添加量的增加，菌液OD600nm分別達到了1.621、1.761、1.768和1.830，L-纈氨酸的最終產(chǎn)量分別達到了48、72、64 g/L和58 g/L。可見生物素添加量對L-纈氨酸產(chǎn)量的影響顯著：在發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素添加量越高，菌體生長越快，最終菌體濃度越高；生物素添加量過高時，菌體生長迅速，發(fā)酵前期產(chǎn)酸速率高，中后期產(chǎn)酸速率下降，最終產(chǎn)量降低；生物素添加量為50μg/L左右時，L-纈氨酸產(chǎn)量最高，菌體量生長適中。

2 生物素添加量對菌體耗糖速率及糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

經(jīng)測算耗糖量，在初糖質(zhì)量濃度80 g/L的發(fā)酵中，隨生物素添加量的增加，初糖質(zhì)量濃度降至10 g/L水平所需發(fā)酵時間減少，依次為22、19、18、16.5 h，可見菌體耗糖速率與生物素添加量呈正相關(guān)；結(jié)果顯示，根據(jù)每4 h所記錄流加糖量，發(fā)酵進行至30 h左右時，耗糖進入高峰階段，菌體生長速率趨于平緩，菌體消耗的葡萄糖更多的用于合成代謝產(chǎn)物，此時L-纈氨酸與L-丙氨酸皆處于快速生成階段；發(fā)酵結(jié)束時，生物素添加量由低到高的批次糖酸轉(zhuǎn)化率依次為24%、32%、27%和22%?？梢姡刂粕锼靥砑恿靠捎行岣週-纈氨酸的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本，提高發(fā)酵生產(chǎn)的效益。

3 生物素添加量對副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸的影響

結(jié)果顯示，發(fā)酵結(jié)束時，隨生物素添加量的增加，L-丙氨酸產(chǎn)量分別為9、12、15、22 g/L?？梢奓-丙氨酸產(chǎn)量與生物素添加量呈正相關(guān)。

4 在線膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝

選取生物素添加量50μg/L的發(fā)酵批次作為標(biāo)準，每間隔4 h取樣離心，測定發(fā)酵液中L-丙氨酸含量與L-纈氨酸含量，結(jié)果顯示，在發(fā)酵前中期，菌體處于生產(chǎn)L-纈氨酸速率較高的階段；發(fā)酵后期，L-纈氨酸產(chǎn)酸速率下降，L-丙氨酸產(chǎn)酸速率提升，因發(fā)酵液內(nèi)L-纈氨酸產(chǎn)量過高而產(chǎn)生反饋抑制現(xiàn)象，菌體內(nèi)代謝流量更多地流向L-丙氨酸方向，使得L-丙氨酸產(chǎn)量增多，降低了L-纈氨酸的轉(zhuǎn)化效率。

如圖8所示，采用在線膜偶聯(lián)透析發(fā)酵工藝，在發(fā)酵進行至28 h時，罐內(nèi)L-纈氨酸質(zhì)量濃度累積至40 g/L，L-丙氨酸質(zhì)量濃度累積超過了3g/L，主產(chǎn)物受到抑制，副產(chǎn)物進入快速生成階段，此時對發(fā)酵液進行在線膜偶聯(lián)透析，分離出發(fā)酵液內(nèi)較高質(zhì)量濃度的L-纈氨酸和L-丙氨酸，截留罐內(nèi)菌體，使其在新加入的透析培養(yǎng)基中迅速恢復(fù)活力并繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸；透析之后，罐內(nèi)L-纈氨酸質(zhì)量濃度降至3 g/L左右，L-丙氨酸質(zhì)量濃度降至0.3 g/L左右，繼續(xù)發(fā)酵24 h左右，罐內(nèi)L-纈氨酸質(zhì)量濃度再次達到40 g/L，且L-丙氨酸也再次累積至3 g/L，此時對發(fā)酵液進行第2次透析，降低罐內(nèi)主副產(chǎn)物的含量，使發(fā)酵延續(xù)下去，延長菌體產(chǎn)酸周期，并大幅提高單批次發(fā)酵總產(chǎn)酸量。

如表2所示，透析前后發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率由32%提高到34.5%，主產(chǎn)物產(chǎn)量增加，副產(chǎn)物產(chǎn)量降低，耗糖量也相應(yīng)增加，罐內(nèi)發(fā)酵液體積更接近初始裝液量，穩(wěn)定性增強。

討論

本實驗使用的菌株XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）在進行生物素不同梯度實驗對比之后發(fā)現(xiàn)，增大生物素添加量后，菌體生物量的確有所增長，但是副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸含量增長更為明顯，因此在利用谷氨酸棒桿菌XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸時，造成L-纈氨酸產(chǎn)量下降的主要原因是丙酮酸節(jié)點流量過多地流向丙氨酸途徑，從而減弱了L-纈氨酸途徑，使產(chǎn)酸減少。

因此，如果能夠從代謝改造的途徑對菌種XV0505（Leu-＋Ile-＋2-TAr＋α-ABr＋SGr）的丙氨酸合成途徑進行干擾或者削弱，丙酮酸節(jié)點流向L-纈氨酸的途徑勢必有所增加，從而進一步提高L-纈氨酸產(chǎn)量.采用在線膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵工藝能夠直接有效地減少L-丙氨酸的生成，最終發(fā)酵液中L-丙氨酸質(zhì)量濃度保持在3 g/L左右，相較之前的12 g/L降了75%左右，是行之有效的解決方式。

結(jié)論

生物素的外源添加對于菌體細胞自身的生長與產(chǎn)酸必不可少，本研究通過對生物素添加量進行梯度控制，確定了谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸過程中最適的生物素添加量。實驗表明，當(dāng)生物素添加量為50μg/L時，經(jīng)過52 h的發(fā)酵，L-纈氨酸產(chǎn)量達到72 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達到32%；在線膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵對于發(fā)酵液中主要產(chǎn)物的反饋抑制解除以及副產(chǎn)物的去除具有非常明顯的效果，較透析之前，透析后的L-纈氨酸總產(chǎn)量提高了47.4%，轉(zhuǎn)化率提高了2.5%，同時副產(chǎn)物L(fēng)-丙氨酸產(chǎn)量下降了75%。目前，膜偶聯(lián)間歇透析發(fā)酵還存在一些有待改進的方面，如果能夠?qū)ξV膜進行一些改進，解決上述問題，可進一步提高生產(chǎn)效益。