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環(huán)形核苷酸是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控?，F(xiàn)已知發(fā)現(xiàn)的第二信使包括環(huán)形腺苷單磷酸(3′,5′-cAMP)、環(huán)形鳥苷單磷酸(3′,5′-cGMP)、環(huán)形胞苷單磷酸(3′,5′-cCMP)、環(huán)形尿苷單磷酸(3′,5′-cUMP)、環(huán)形二鳥苷酸(c-di-GMP)，環(huán)形二腺苷酸(c-di-AMP)及環(huán)形鳥苷腺苷酸(cGAMP)。除了上述已發(fā)現(xiàn)的環(huán)形核苷酸類第二信使外，在2009年埃德溫(Edwin)等人還首次在人的腎臟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了腺苷-2',3'-環(huán)磷酸(2′,3′-cAMP)，隨后人們又在哺乳動物的大腦等組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了腺苷-2',3'-環(huán)磷酸的存在。科研人員還從植物細(xì)胞中檢測到腺苷-2',3'-環(huán)形單磷酸和鳥苷-2',3'-環(huán)磷酸(2′,3′-cGMP)，從一株熒光假單胞菌中檢測到胞苷-2',3'-環(huán)磷酸(2′,3′-cCMP)和尿苷-2',3'-環(huán)形單磷酸(2′,3′-cUMP)的存在?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，這四種2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸很可能代表了另外一類新型的生物細(xì)胞第二信使。由于2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸吸引了越來越多的關(guān)注，其在科學(xué)研究和醫(yī)學(xué)上的需求也日益增多。目前2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸的制備均采用化學(xué)合成的方法，尚未有生物制備方法?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸，產(chǎn)量低，價格高，在一定程度上限制了其開發(fā)應(yīng)用。
步驟1：2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸混合物的提取
(1)將洗脫得到的目的蛋白LfliZ，0℃靜置3d，此時蛋白溶液將會出現(xiàn)明顯的沉淀。將蛋白溶液12000rpm離心20min，得到上清液；
(2)將步驟(1)中得到的上清液，用截留分子量為3K的超濾管超濾，去除殘留的蛋白，超濾膜濾過液即為含有4種2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸溶液；
步驟2：四種環(huán)形核苷酸腺苷-2',3'-環(huán)磷酸，2′,3′-cGMP，2′,3′-cCMP和2′,3′-cUMP純品的提取
(1)將得到的2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸溶液，采用C18反向色譜柱進(jìn)行高效液相色譜分離得到四種2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸純品；所用的流動相為：A液，10mM醋酸銨溶液，pH5.0；B液，75％A液加入25％甲醇；
(2)上述步驟中所用的分離程序為：0min，B液0％；2.5min，B液0％；5min，B液30％；10min，B液60％；14min，B液100％；21min，B液100％；22min，B液50％；23min，B液0％；30min，B液0％。流速為10mL/min，檢測波長為254nm。
步驟3：四種純品2',3'-環(huán)形核苷單磷酸產(chǎn)量檢測
(1)將購買的4種2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水稀釋到如下濃度梯度：0μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM，采用C18反向色譜柱進(jìn)行高效液相色譜檢測各濃度的環(huán)形核苷單磷酸標(biāo)準(zhǔn)品所對應(yīng)的峰面積，之后以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)利用做好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將制備好的4種2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸樣品用C18反向色譜柱進(jìn)行高效液相色譜分別檢測濃度可得，每升培養(yǎng)液可提取1.30±0.17μmol的2',3'-cCMP、1.40±0.12μmol的2',3'-cUMP、2.81±0.25μmol的2',3'-cGMP和2.61±0.19μmol的腺苷-2',3'-環(huán)磷酸。根據(jù)4種2′,3′-環(huán)形核苷單磷酸的分子量，將上述摩爾量換算成質(zhì)量計算可得，每升培養(yǎng)液可提取約2.5mg的四種純品2',3'-環(huán)形核苷單磷酸。
[1] CN201610430027.3 一種海洋細(xì)菌基因LfliZ及應(yīng)用