6199-67-3葫蘆素B的作用

背景及概述^[1-2]

葫蘆素B ( cucurbitacin B ) 是從葫蘆科等植物中分離得到的一類(lèi)四環(huán)三萜類(lèi)化合物，是葫蘆素家族中含量最豐富的成員，具有廣泛的藥理活性?，F(xiàn)代研究表明，葫蘆素B 具有保護(hù)肝、消炎和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性。20 世紀(jì)70 ～80年代，國(guó)內(nèi)已研發(fā)出葫蘆素片( 含葫蘆素B 和葫蘆素E)用于肝炎和原發(fā)性肝癌的輔助治療。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)葫蘆素B 的抗腫瘤作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 具有較強(qiáng)的抑制STAT3 轉(zhuǎn)錄因子活化的作用，并認(rèn)為其抗腫瘤活性與抑制STAT3 轉(zhuǎn)錄因子的活化有關(guān)。然而，也有不少研究報(bào)道，葫蘆素B 的藥理活性與抑制STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活化無(wú)關(guān)。目前較多研究表明，葫蘆素B可導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的快速破壞，這種作用與其抗腫瘤作用密切相關(guān)。由此可見(jiàn)，葫蘆素B 抗腫瘤作用機(jī)制還存在爭(zhēng)議，待深入研究。

結(jié)構(gòu)

作用機(jī)制^[1]

葫蘆素B 有廣泛抗腫瘤活性，其抗腫瘤機(jī)制可能包括以下幾方面。

1）葫蘆素B 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象，是維持體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)平衡的基本措施，而腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖和凋亡抑制，造成其無(wú)限制增殖。因此利用各種治療手段促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是抗腫瘤治療的重要策略之一。葫蘆素B主要通過(guò)抑制Bcl-2、激活Caspase 瀑布、降解PAＲP 從而誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

2）葫蘆素B 誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯

高等真核細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)依賴(lài)于細(xì)胞周期蛋白( cyclin) 和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶( cyclin-dependent kinases，CDKs) 。多項(xiàng)研究均顯示葫蘆素B 通過(guò)降低CyclinB1、CDC2 和cdc25C 的表達(dá)，增加P21 和P53 的表達(dá)使多種腫瘤細(xì)胞阻滯于G2 /M 期。

3）葫蘆素B 可破壞細(xì)胞骨架

實(shí)驗(yàn)研究表明葫蘆素B 可快速改變?nèi)橄侔㎝CF-7細(xì)胞形態(tài)，使F-actin 和微管聚集，以致細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞。葫蘆素B 被認(rèn)為是第三種以微管為靶點(diǎn)的藥物(紫杉類(lèi)、長(zhǎng)春堿類(lèi)、現(xiàn)在的葫蘆素B) 。葫蘆素B 還能使惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架破壞從而影響細(xì)胞的遷移。

4）葫蘆素B 阻斷細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑

腫瘤的發(fā)生發(fā)展總與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常有關(guān)，而葫蘆素B 可影響多條信號(hào)傳導(dǎo)通路。近期多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 可抑制STAT3 的磷酸化，從而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡等。STAT3 已被認(rèn)為是一種癌基因。葫蘆素B 可通過(guò)反式激活ＲelA/p65 抑制NF－kappaB 信號(hào)通路。

應(yīng)用^[1]

圍繞葫蘆素B 的抗腫瘤作用，人們開(kāi)展了多項(xiàng)研究，結(jié)果表明葫蘆素B 對(duì)某些腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物模型有明顯的抗腫瘤作用。

1.肝癌

研究指出葫蘆素B 抑制肝細(xì)胞癌HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，主要通過(guò)抑制STAT3 磷酸化，降低Bcl- 2 表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。葫蘆素B 對(duì)另一肝細(xì)胞癌BEL- 7402 細(xì)胞有抑制作用，并在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中以1 mg /kg 的劑量口服能顯著抑制移植瘤生長(zhǎng)。

2.乳腺癌

葫蘆素B 通過(guò)破壞細(xì)胞骨架，抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，并認(rèn)為葫蘆素B 也許是第三種以微管為靶點(diǎn)的藥物( 紫杉類(lèi)、長(zhǎng)春堿類(lèi)、現(xiàn)在的葫蘆素B) 。進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞SKBＲ- 3的抑制作用更為明顯，其也許通過(guò)下調(diào)hTEＲT 和c- myc、抑制端粒酶，發(fā)揮抗腫瘤作用。近期研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素B誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制的部分原因也許是wnt 信號(hào)傳導(dǎo)通路的抑制。

3.喉癌

研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 通過(guò)抑制STAT3 信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)喉癌細(xì)胞Hep- 2 的抗腫瘤作用，并且在動(dòng)物模型中其也能抑制移植瘤生長(zhǎng)。進(jìn)一步探索，在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中證明葫蘆素B 聯(lián)合多西他塞或順鉑均可協(xié)同抑制喉癌生長(zhǎng)。

4.胰腺癌

葫蘆素B 可顯著抑制多種胰腺癌細(xì)胞( MiaPaCa- 2、PL45、Panc- 1 和AsPc- 1) 生長(zhǎng)，其抑制作用與JAK2、STAT3、和STAT5 抑制而引起的G2 /M期阻滯和細(xì)胞凋亡有關(guān)。而且還發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 和吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用。

5. 其他腫瘤

葫蘆素B 對(duì)其他惡性腫瘤細(xì)胞系也表現(xiàn)出顯著抗腫瘤作用。葫蘆素B 可通過(guò)增加活性氧(ＲOS) 和一種抗氧化劑來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW480。研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 通過(guò)ＲOS依賴(lài)的G- actin 池降解使actin 聚集從而抑制黑色素瘤B16F10 細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，而且還發(fā)現(xiàn)丙戊酸(VPA) ，一種組蛋白脫乙?；缚稍鰪?qiáng)B16F10 對(duì)葫蘆素B 處理的敏感性。還有研究表明葫蘆素B 可顯著抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌的增殖。

6. 葫蘆素B 與其他化療藥物的協(xié)同作用

在臨床上，很多藥物聯(lián)合應(yīng)用，不僅增強(qiáng)療效而且避免耐藥細(xì)胞產(chǎn)生和降低藥物毒性。有一些研究顯示葫蘆素B聯(lián)合化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞有協(xié)同作用，如現(xiàn)在胰腺癌動(dòng)物模型中，葫蘆素B 聯(lián)合吉西他濱具有協(xié)同作用，且不增加毒性研究顯示葫蘆素B 和順鉑的協(xié)同作用。葫蘆素B 聯(lián)合其他化療藥物值得進(jìn)一步研究。

7. 葫蘆素B 引起細(xì)胞自噬

研究發(fā)現(xiàn)葫蘆素B 可以增加黑色素瘤B16F10 細(xì)胞中eIFα 磷酸化水平和自噬相關(guān)蛋白LC- 3Ⅱ表達(dá)。但是葫蘆素B 能否像其他作用于細(xì)胞骨架的藥物一樣，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激( EＲstress) 和自噬，并且引起的自噬是否影響細(xì)胞增殖生長(zhǎng)還有待進(jìn)一步研究。

制備^[3-4]

方法1：一種葫蘆素B的提取分離方法，包括如下步驟：

1)將原料甜瓜蒂粉碎，用乙醇滲漉乙醇回流提取，提取液濃縮以后，用乙酸乙酯萃取三次以上，回收乙酸乙酯，即得總葫蘆素提取物；

2)取總葫蘆素提取物溶于體積分?jǐn)?shù)25～45％的乙醇水溶液中，在醋酸存在下進(jìn)行水解反應(yīng)，充分反應(yīng)后調(diào)節(jié)pH值至中性，濃縮至干；所述醋酸的濃度為0.1～0.3mol/L；

3)步驟2)所得濃縮物經(jīng)純化處理得到葫蘆素B含量在60％以上的葫蘆素B產(chǎn)品。

方法2：一種從甜瓜蒂中制備高純度葫蘆素B的方法。首先采用微波逆流提取葫蘆素，提高了產(chǎn)品的得率。通過(guò)大孔樹(shù)脂對(duì)其進(jìn)行純化，大孔樹(shù)脂再生方便，適合大生產(chǎn)，容易操作。大孔樹(shù)脂和硅膠柱層析結(jié)合，分離和純化效果好，最后采用重結(jié)晶，使產(chǎn)品純度進(jìn)一步提高，最終得到含量90％以上的葫蘆素B終產(chǎn)品。它包括以下步驟：

(1)微波逆流提?。簩⑻鸸系俜鬯?，過(guò)篩60-80目，加入60-80％甲醇溶液，在400-600W，時(shí)間60- 120min，8-12倍料液比條件下微波逆流提取，正向進(jìn)料，反向進(jìn)水，物料與水的流動(dòng)為逆向連續(xù)動(dòng)態(tài)流動(dòng)，得到含有葫蘆素的提取液；

(2)活性炭脫色：將提取液減壓濃縮至無(wú)醇，加入0.25-0.40倍量的活性炭，室溫條件下，機(jī)械攪拌脫色0.5h，過(guò)濾除去活性炭；

(3)樹(shù)脂純化：將溶液采用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行吸附，吸附完畢用水以4-6BV/h流速洗去水溶性雜質(zhì)，洗脫體積為5-7BV，然后用60％-90％的乙醇溶液以1-3BV/h流速洗脫，洗脫體積為4- 6BV，得葫蘆素B洗脫液，將洗脫液濃縮至浸膏，真空冷凍干燥，得葫蘆素B粗粉；

(4)硅膠柱層析：將所得葫蘆素B粗粉溶于乙酸乙酯加適量硅膠攪拌，烘干過(guò)60-80目篩，干法上樣，上硅膠柱層析，以氯仿-甲醇溶液進(jìn)行洗脫，薄層色譜法跟蹤檢測(cè)，收集葫蘆素B各階段洗脫液；

(5)重結(jié)晶：將所收集的葫蘆素B洗脫液濃縮，冷凍干燥得粉末。用乙酸乙酯水溶液溶解，過(guò)濾，回收乙醇，濃縮，放置析出晶體，再反復(fù)重結(jié)晶兩次，得到高純度葫蘆素B。

主要參考資料

[1] 葫蘆素B 抗腫瘤作用的研究進(jìn)展

[2] 葫蘆素B 抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展

[3] CN200910154837.0一種葫蘆素B的提取分離方法

[4] CN201610922396.4一種從甜瓜蒂中提取葫蘆素B的方法