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胡蘆巴為豆科植物胡蘆巴Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟種子。具有溫腎，祛寒，止痛的功用，性味苦，溫，歸腎經(jīng)。用于腎臟虛冷，小腹冷痛，小腸疝氣，寒濕腳氣?，F(xiàn)代藥理研究表明，胡蘆巴具有抗糖尿病、降膽固醇及對(duì)急性化學(xué)性肝損傷的保護(hù)作用。胡蘆巴堿為胡蘆巴中的主要成分，具有抗腫瘤作用，在12.5mg/kg水平上能使白血病P-388小鼠聲明延長(zhǎng)31％。對(duì)動(dòng)植物的細(xì)胞和組織有促使停止生長(zhǎng)的作用。同時(shí)可治療某些皮膚病，例如牛皮癬等。
葫蘆巴堿( TRG) 是從豆科植物蝶形花亞科葫蘆巴屬葫蘆巴的干燥種子中分離的一種生物堿，因而定名葫蘆巴堿，是葫蘆巴干燥種子中的主要生物堿之一。在中醫(yī)藥典中，TRG 具有溫腎、祛寒、止痛之功效，是治療腎臟冷虛、小腹冷痛、寒濕腳氣的主要藥物。在西醫(yī)治療中，TRG 主要用于治療糖尿病、腫瘤和肝損傷等。
因此，人們對(duì)葫蘆巴堿的醫(yī)用價(jià)值比較重視。自Evans 等提出葫蘆巴堿具有促進(jìn)細(xì)胞周期G2 期停止的作用，具備植物激素的特性，引起人們的關(guān)注。近些年，有關(guān)葫蘆巴堿的研究資料越來越多，并涉及到植物的各種生理生化功能，受到人們的關(guān)注，已成為研究的熱點(diǎn)。鹽酸胡蘆巴堿為葫蘆巴堿的鹽酸鹽。
葫蘆巴堿是一種生物堿，葫蘆巴屬葫蘆巴種子中含量較高，達(dá)到種子干重的0.13%。青咖啡豆在烘烤后含有大量的葫蘆巴堿，并且是咖啡中的主要揮發(fā)性物質(zhì)，是主要的提神物質(zhì)。葫蘆巴堿廣泛存在于不同高等植物中。大豆和苜蓿干燥種子中含有葫蘆巴堿?？Х葮涞母鞑糠制鞴俣己泻J巴堿，其中根系的含量小于地上組織。
在白皮云杉( Picea glauca) 的種子胚中含有葫蘆巴堿。在紫茉莉根中，胡蘆巴堿含量為0.15 ～0.19 mg /g。當(dāng)植物受到鹽脅迫和水分逆境時(shí)，植物體內(nèi)葫蘆巴堿大量積累。另外，已發(fā)現(xiàn)含有葫蘆巴堿的植物有：茄( Soanum melongenaL.) 的葉；使君子( Quisqualis indica L.) 的葉和種子；南瓜( Cucurbita moschata Duch.) 的果實(shí)；臭馬比木( Mappia foetidaMiers) ；田皂( Aeschynomene indica) 的全草；小葉買麻藤［Gnetum parvifolium( Warb.) C.Y.Cheng］的藤；白亮羊蹄甲( Bauhinia candicans) ；相思子( Aburs precatorius L.) 的種子；兵豆( Lens culinaris Medic) 的種子；臭味假柴龍樹( Nothapodytesfoetida( Wight) Sleum.) 的莖。
葫蘆巴堿是尼克酸甲基化的產(chǎn)物，是植物體內(nèi)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸( NAD) 和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸( NADP) 代謝或轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的。利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法，借助3H 示蹤技術(shù)，研究了葫蘆巴堿的代謝過程。
喹啉酸在磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)變成為尼克酸單核苷酸，從尼克酸單核苷酸開始有2 條代謝途徑形成葫蘆巴堿：一是尼克酸單核苷酸在5' -核苷酸酶和嘌呤核苷酸分解酶的作用下形成尼克酸，尼克酸轉(zhuǎn)化成N-糖苷尼克酸和葫蘆巴堿；另一條途徑是尼克酸單核苷酸在尼克酸嘌呤核苷轉(zhuǎn)移酶作用下轉(zhuǎn)化成尼克酸腺嘌呤二核苷酸，在NAD 合成酶催化下轉(zhuǎn)化成NAD，由NAD 通過5' -核苷酸酶和嘌呤核苷酸分解酶的連續(xù)催化下形成尼克酸，再可進(jìn)行尼克酸轉(zhuǎn)化成N-糖苷尼克酸和葫蘆巴堿。
第2 條途徑中的NAD 是受吡啶核苷酸循環(huán)的影響，在形成葫蘆巴堿的過程中整個(gè)吡啶核苷酸循環(huán)的周轉(zhuǎn)速度可能很快。由此可見，葫蘆巴堿可以作為尼克酸的儲(chǔ)存物質(zhì)。循環(huán)會(huì)受到細(xì)胞內(nèi)Pi 濃度大小的影響，同時(shí)吡啶化合物的吸收、代謝和嘌呤代謝緊密相關(guān)。吡啶化合物的運(yùn)輸系統(tǒng)需要ATP，NAD 的合成也需要ATP的供給。Ashihara 等進(jìn)一步分析認(rèn)為：在缺磷細(xì)胞中，吡啶化合物低吸收量和NAD 低合成量與合成ATP 或GTP 量較少有關(guān)。
鹽酸胡蘆巴堿可主要用于治療糖尿病、腫瘤和肝損傷等。此外，其在植物體內(nèi)也具有一定作用。
葫蘆巴堿在植物細(xì)胞中具有調(diào)解細(xì)胞生長(zhǎng)周期的作用。細(xì)胞周期是指從一次細(xì)胞分裂結(jié)束形成子細(xì)胞到下一次分裂結(jié)束形成新的子細(xì)胞所經(jīng)歷的時(shí)間。細(xì)胞周期可分為以下4 個(gè)時(shí)期：M 期、G1期、S期和G2期。M 期：從細(xì)胞分裂開始到結(jié)束，包括染色體的凝縮、分離并平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞，分裂后的細(xì)胞內(nèi)DNA 減半，這個(gè)時(shí)期亦稱D 期。
G1期：從有絲分裂完成到DNA 復(fù)制之前的這段間隙時(shí)間，在這段時(shí)期中有各種復(fù)雜大分子包括mRNA、tRNA、rRNA 和蛋白質(zhì)的合成。S 期：DNA 復(fù)制時(shí)期，這期間DNA 的含量增加1 倍。G2期：從DNA 復(fù)制完成到有絲分裂開始的一段間隙。細(xì)胞周期嚴(yán)格按照G1→S→G2→M 的順序運(yùn)轉(zhuǎn)。發(fā)現(xiàn)，豌豆( Pisum sativum) 子葉的提取物能使豌豆根尖和莖尖分生組織的細(xì)胞周期中的G2期停止( G2 arrest)或減慢G2期。
經(jīng)過鑒定，這種提取物的有效成分為葫蘆巴堿。后來發(fā)現(xiàn)，在未萌發(fā)的種子中有大量的葫蘆巴堿，種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)移到幼苗的各個(gè)器官中。當(dāng)葫蘆巴堿溶液的濃度達(dá)到10-7mol /L 時(shí)，根部分生組織細(xì)胞中45%的細(xì)胞處在G2期。由于葫蘆巴堿在根系分生區(qū)的積累，細(xì)胞大部分進(jìn)入G2期，延長(zhǎng)了細(xì)胞的G2時(shí)期。
所以，葫蘆巴堿被認(rèn)為是一種天然的植物激素。以萵苣( Lactuca sativa L.) 的根尖組織作為試驗(yàn)材料，利用DNA 放射自顯影技術(shù)，用3 mmol /L 葫蘆巴堿處理根尖組織，發(fā)現(xiàn)DNA 復(fù)制子的長(zhǎng)度為31 μm，沒有經(jīng)過葫蘆巴堿處理的DNA 復(fù)制子長(zhǎng)度為13 μm。說明葫蘆巴堿處理可避免DNA 復(fù)制子在S 期DNA 復(fù)制發(fā)生綁扎現(xiàn)象，延長(zhǎng)了細(xì)胞周期中的G2期，或G2期停止，減小了原生根系的伸長(zhǎng)速率。
根瘤菌是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌，與相應(yīng)的豆科植物及少數(shù)非豆科植物根系共生，能將空氣中的分子態(tài)氮還原為植物可利用的氨，同時(shí)根瘤菌則從豆科植物中獲得其生長(zhǎng)繁殖所需的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。宿主植物根系在根際周圍分泌類黃酮，類黃酮可作為信號(hào)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了固氮菌和宿主之間的識(shí)別。苜蓿根系分泌的葫蘆巴堿能激活調(diào)節(jié)蛋白NodD2，從而誘導(dǎo)結(jié)瘤基因nod 的表達(dá)。
在研究苜蓿( Medicagosativa L.) 根瘤固氮時(shí)發(fā)現(xiàn)，苜蓿根系釋放葫蘆巴堿到根際，能激活trc 基因的表達(dá)，促進(jìn)了根瘤菌侵染根系的能力。因此，葫蘆巴堿可作為信號(hào)物質(zhì)存在于宿主植物中。豆科植物中的葫蘆巴堿是由位于pSym 質(zhì)粒上的基因所控制的。Rhizobium meliloti 菌株RCR2011 上的多基因位點(diǎn)控制著葫蘆巴堿的代謝。
通過對(duì)Tn5-B20 基因缺陷型的根瘤菌研究表明，trc 基因位于nifAB 和fdxN 基因下游，約9 kb 長(zhǎng)度。葫蘆巴堿可以作為碳源，能增強(qiáng)土著根瘤菌的侵染能力，提高豆科植物的固氮能力。AM 真菌與植物共生，可以提高植物根系對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收能力，增強(qiáng)植物在逆境下的生存能力。AM 真菌能與絕大多數(shù)的高等植物( 主要是草本植物及少部分木本植物) 形成共生體系。
在研究半干旱地區(qū)的一種豆科灌木植物Prosopis laevigata 與AM 真菌的共生關(guān)系時(shí)，利用核磁共振和質(zhì)譜儀鑒定出P.laevigata 根系分泌出葫蘆巴堿。當(dāng)沒有AM 真菌存在時(shí)，P.laevigata 分泌的葫蘆巴堿含量比較穩(wěn)定；當(dāng)根際中AM 真菌存在時(shí)，P．laevigata 根系分泌的TRG 含量增加了1.8 倍，說明TRG 作為信號(hào)物質(zhì)，在P.laevigata 和AM 真菌的共生體系中起著重要作用。
植物在氧化脅迫和紫外脅迫，以及施用誘導(dǎo)植物突變的物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞中的DNA 鏈出現(xiàn)斷裂是這些逆境破壞的結(jié)果之一。尼克酰胺作為植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)，激活A(yù)DP-Rib 聚合酶( PADPRP) 的活性。
在正常的DNA 存在情況下，PADPRP 處于鈍化狀態(tài)，只有DNA 鏈發(fā)生斷裂時(shí)，PADPRP活性被激活。PADPRP 的激活并不是在基因的數(shù)量上，而是體現(xiàn)在PADPRP 與斷裂DNA 的相互作用上。PADPRP 作為位置接近于DNA 結(jié)合蛋白的ADP-Rib 聚合酶，當(dāng)PADPRP活性增加，會(huì)消耗大量的ADP-Rib，ADP-Rib 主要來自于尼克酰胺和葫蘆巴堿的降解。
因此，植物細(xì)胞受到氧化脅迫和紫外脅迫時(shí)，葫蘆巴堿發(fā)揮著非常重要的作用( 即抗紫外脅迫和氧化脅迫的作用) 。這種結(jié)果在UV-B 脅迫下豌豆葉片上得到了進(jìn)一步證明。在強(qiáng)紫外線照射下，豌豆葉片中積累了大量的葫蘆巴堿和尼克酰胺等物質(zhì)，可有效地作為植物體針對(duì)氧化脅迫發(fā)出的信號(hào)分子，同PADPRP 一起在植物防御代謝過程中起到重要作用。
在鹽和干旱脅迫下，植物細(xì)胞積累有活性的無毒害作用的溶質(zhì)，降低滲透勢(shì)，保持體內(nèi)的水分。葫蘆巴堿是一種細(xì)胞質(zhì)中的親和性溶質(zhì)，是細(xì)胞中一種較好的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性起到重要的保護(hù)作用。在鹽脅迫下，葫蘆巴堿改變植物體內(nèi)離子的分布，穩(wěn)定脅迫下大分子的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫環(huán)境的適應(yīng)。
主要是由晝夜光暗變化引起的。葉片在白天合成生長(zhǎng)素，運(yùn)到葉柄下半側(cè)，K+ 和Cl-也運(yùn)輸?shù)缴L(zhǎng)素濃度高的地方，水分就進(jìn)入葉枕，細(xì)胞膨脹，導(dǎo)致葉片高挺。到晚上，生長(zhǎng)素運(yùn)輸量減少，進(jìn)行相反反應(yīng)，葉片就下垂。利用1 ×10-7 mol /L 葫蘆巴堿處理Aeschynomene indica 葉片發(fā)現(xiàn)，葉片在白天閉合，其效果與生長(zhǎng)素相類似，主要是葫蘆巴堿與葉片張開的因子生長(zhǎng)素相互競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，可作為植物體內(nèi)的晝夜節(jié)奏的信號(hào)物質(zhì)。
DNA 甲基化是在不改變基因組序列的前提下，通過DNA 和組蛋白的修飾來控基因表達(dá)。DNA 甲基化是一種由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶( DNMTs) 介導(dǎo)的，以S-腺苷蛋氨酸( SAM) 為甲基供體，DNA 的胞嘧啶環(huán)5 位獲得甲基而形成5-甲基胞嘧啶的過程，是造成植物轉(zhuǎn)基因沉默的主要原因之一。在基因遺傳轉(zhuǎn)化過程中，即外源基因“入侵”時(shí)，尼克酸含量大量增加。
DNA 甲基化修飾主要是DNA 胞嘧C-5 位甲基轉(zhuǎn)移酶( DNA 甲基化酶) 識(shí)別DNA 的5'-CG-3'序列( CpG) ，把SAM 的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5 位，生成5 甲基胞嘧啶( 5mC) 。煙堿( nicotinamide) 脫酰胺后形成尼克酸，尼克酸甲基化后形成葫蘆巴堿，消耗DNA 甲基化的甲基供體( SAM)。因此，葫蘆巴堿代謝影響DNA 的甲基化，與基因沉默密切相關(guān)
目前，鹽酸胡蘆巴堿的檢測(cè)主要有液相色譜法。檢測(cè)胡蘆巴酊中胡蘆巴堿的含量，對(duì)控制胡蘆巴酊的內(nèi)在質(zhì)量具有一定的參考價(jià)值。有研究開發(fā)一種胡蘆巴酊中胡蘆巴堿的測(cè)定方法，是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：胡蘆巴酊中胡蘆巴堿的測(cè)定方法如下：樣品過0.45μm濾膜后直接進(jìn)樣，以NH2柱為分析柱，水和乙腈為流動(dòng)相，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，其中檢測(cè)器是二極管陣列檢測(cè)器。
測(cè)定方法具體包括以下步驟：
1）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制定：在1.848×10-3-2.31mg/mL范圍內(nèi)用甲醇配制葫蘆巴堿標(biāo)準(zhǔn)品的至少五個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再利用高效液相色譜儀分別對(duì)上述所有濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中的標(biāo)準(zhǔn)品的含量進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積和相應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并計(jì)算得到其回歸方程；
2）樣品制備：胡蘆巴酊過0.45μm濾膜后直接進(jìn)樣，再利用高效液相色譜儀采用與步驟（1）相同的條件分別對(duì)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)得到的峰面積分別帶入標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的回歸方程中，計(jì)算出樣品中的含量。
高效液相色譜分析條件如下：色譜柱Agilent，NH2分析柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：A為水，B為乙腈；梯度洗脫條件：90%B開始，8min后75%B，18min后50%B，23min后30%B，23min以90%B平衡柱子5min，分析時(shí)間共28min；流速1mL/min；進(jìn)樣量5μL；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：265nm。
之所以選用以NH2柱為分析柱，是因?yàn)楹J巴堿是內(nèi)鹽，極性極大，在C18柱上保留極小，在分析胡蘆巴堿時(shí)不易與雜質(zhì)分離，所以，采用極性固定相的NH2柱，可增強(qiáng)胡蘆巴堿在柱上的保留時(shí)間。而在選用流動(dòng)相時(shí)，最初選用甲醇和水的混合體系，發(fā)現(xiàn)胡蘆巴堿色譜峰產(chǎn)生拖尾，而采用乙腈為流動(dòng)相時(shí)，胡蘆巴堿色譜峰形對(duì)稱。最終采用乙腈和水作為流動(dòng)相，利用NH2柱分離胡蘆巴堿。
一種胡蘆巴堿的提取工藝，其特征在于包括以下步驟：
1)將胡蘆巴種子粉碎，放在氨醇溶液或含水乙醇中混合浸泡并同時(shí)進(jìn)行超聲波處理，浸泡后的混合溶液加熱回流提??；
2)將提取液濃縮至小體積后加入等體積的石油醚萃取，分2-6次萃取，棄去萃取液；
3)將萃余液與2-5倍氧化鋁拌樣，烘干，通過氧化鋁柱層析，用異丙醇或乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮，干燥；
4)將干燥后的提取物用乙醇復(fù)溶，抽濾或離心，濾液或上清液減壓回收乙醇，干燥即得胡蘆巴堿。
5）胡蘆巴堿與鹽酸成鹽即得鹽酸葫蘆巴堿。
[1] CN201010210259.0一種葫蘆巴堿的提取工藝
[2] CN201110002937.9胡蘆巴酊中胡蘆巴堿的測(cè)定方法
[3] 武菲, 付玉杰. 葫蘆巴堿在植物體內(nèi)的生理功能[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(10): 5876-5878.