61-90-5 / L-亮氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)方法

背景及概述^[1]

L-亮氨酸(L-leucine)又稱白氨酸，即α-氨基-γ-甲基戊酸、α-氨基異己酸，分子式為C6H13O2N。1819年P(guān)roust首先從奶酪中分離得到，后來Braconnot從肌肉與羊毛的酸水解物中得到結(jié)晶，并定名為亮氨酸。亮氨酸與纈氨酸、異亮氨酸同屬于支鏈氨基酸，是人體八大必需氨基酸之一。L-亮氨酸具有多種生理功能，在醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面應(yīng)用廣泛。

制備^[1]

一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法

(1)活化培養(yǎng)：取L-亮氨酸生產(chǎn)菌(即谷氨酸棒桿菌ACCC16522，購自上海復(fù)祥生物科技有限公司)接種至活化培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中32℃活化培養(yǎng)12h，得到活化菌。

活化培養(yǎng)基：無水葡萄糖1g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、NaCl2.5g/L、瓊脂粉20g/L，pH＝7.0-7.2。

(2)種子培養(yǎng)：取一環(huán)生長(zhǎng)良好的活化菌接種至含有種子培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，裝液量為200mL/500mL，種子培養(yǎng)的條件為32℃，150r/min搖床培養(yǎng)20h，用分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液中的菌體濃度，菌體OD620值達(dá)到1.2可作為合格的種子液，得到種子液。

種子培養(yǎng)基：無水葡萄糖20g/L、玉米漿干粉25g/L、硫酸銨2g/L、KH₂PO₄·3H₂O1.5g/L、維生素B1 300μg/L、生物素200μg/L，pH＝7.0-7.2。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：按照10％的接種量，取步驟(2)得到的種子液，接種至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中，裝液量為6L/10L，培養(yǎng)溫度為30℃-35℃，攪拌轉(zhuǎn)速600rpm/min，在培養(yǎng)過程中加入補(bǔ)料培養(yǎng)基，前12h的通氣量為80-100L/h，12h之后的通氣量為100-120L/h，通過自動(dòng)流加氨水控制發(fā)酵過程中pH＝6.6±0.05，培養(yǎng)30-32h，得到發(fā)酵液。發(fā)酵結(jié)束時(shí)間以產(chǎn)酸不再增加為判斷標(biāo)準(zhǔn)。發(fā)酵培養(yǎng)前后，用高效液相色譜法測(cè)定L-亮氨酸含量；利用生物傳感分析儀檢測(cè)發(fā)酵液殘?zhí)堑暮俊?/p>

發(fā)酵培養(yǎng)基：蘋果酸鈉2.0-4.0g/L、無水葡萄糖140-160g/L、玉米漿干粉35g/L、硫酸銨20g/L、KH₂PO₄·3H₂O 1.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.4g/L、MnSO₄·H₂O 0.1g/L、維生素B1 300μg/L、生物素50μg/L、CaCO₃ 30g/L、消泡劑0.5％，pH＝7.0-7.2。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：蘋果酸鈉1.0g/L、肌醇1.0-2.0g/L、玉米漿干粉12g/L、硫酸銨25g/L、KH₂PO₄·3H₂O 2.0g/L、MgSO₄·7H₂O 0.6g/L、MnSO₄·H₂O 0.3g/L、維生素B1 400μg/L、生物素60μg/L、CaCO₃ 20g/L、消泡劑1.0％，pH＝7.0-7.2。

(4)L-亮氨酸的提取：取發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液，8000r/min離心10min，收集上清液，將上清液過離子交換柱提取純化，0.5BV/h流速上樣，上樣量為260mL的發(fā)酵液，所用洗脫劑為3.0mol/L的氨水，洗脫流速為0.1-1.0BV/h，收集流出液，用高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液和流出液中L-亮氨酸的含量，計(jì)算得率。

參考文獻(xiàn)

[1] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)] CN201910065390.3 一種發(fā)酵生產(chǎn)L-亮氨酸的方法