60-18-4 / 對(duì)羥基苯丙氨酸的應(yīng)用

概述 ^[1]

對(duì)羥基苯丙氨酸（tyrosine；Tyr）是人類(lèi)成長(zhǎng)過(guò)程中必不可少的氨基酸，如果體內(nèi)缺乏酪氨酸則可能會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)智能下降，白化病等癥狀。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外已普遍開(kāi)始重視食品中酪氨酸含量的添加。因此，準(zhǔn)確、靈敏的測(cè)定酪氨酸在營(yíng)養(yǎng)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)上具有重要意義。由于DL-m-酪氨酸（間羥基苯丙氨酸）和L-酪氨酸（對(duì)羥基苯丙氨酸）分子式相同、結(jié)構(gòu)相近，因此使得他們的一些物理和化學(xué)性質(zhì)也相似，且兩者的外觀也極為相似，導(dǎo)致兩者難以區(qū)分。目前雖然已有很多報(bào)道關(guān)于定量分析酪氨酸濃度的方法，例如HPLC、電化學(xué)分析法、化學(xué)發(fā)光法、毛細(xì)管電泳法。但是，關(guān)于對(duì)DL-m-酪氨酸（間羥基苯丙氨酸）和L-酪氨酸（對(duì)羥基苯丙氨酸）兩種同分異構(gòu)體的區(qū)分鑒別尚無(wú)報(bào)道。因此，迫切需要一種鑒定效果好且操作簡(jiǎn)便快速、結(jié)果容易判斷的方法來(lái)鑒別這兩種物質(zhì)。

應(yīng)用^[2]

對(duì)羥基苯丙氨酸是尿液檢測(cè)劑，用于檢測(cè)早期癌癥，主要就是檢測(cè)對(duì)羥基苯丙氨酸在尿液中的含量。腫瘤標(biāo)志物中，對(duì)羥基苯丙氨酸及其代謝物在尿液中異常的腫瘤生命體中，所以被眾檢用來(lái)當(dāng)做篩查標(biāo)志物，準(zhǔn)確度極高。

研究表明，對(duì)羥基苯丙氨酸的代謝紊亂不僅導(dǎo)致多種氨基酸代謝疾病的發(fā)生，而且與惡性腫瘤有一定的相關(guān)性。因此，研究人體體液中酪氨酸及其代謝產(chǎn)物的含量變化，對(duì)于多種疾病的輔助診斷、療效監(jiān)測(cè)病因?qū)W等方面的研究意義重大。

現(xiàn)有文獻(xiàn)記載中，癌癥患者尿液中的對(duì)羥基苯丙氨酸濃度較正常人群會(huì)有明顯升高，對(duì)羥基苯丙氨酸作為一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物逐漸開(kāi)始被廣泛關(guān)注。目前，已報(bào)道的對(duì)羥基苯丙氨酸檢測(cè)方法多是檢測(cè)試劑與對(duì)羥基苯丙氨酸結(jié)合形成特定顏色，并與標(biāo)準(zhǔn)色卡對(duì)比，得出陽(yáng)性或陰性的結(jié)論。這種方法只可進(jìn)行簡(jiǎn)單的定性而不可進(jìn)行定量，且該方法干擾因素較多，易形成假陽(yáng)性或假陰性。

檢測(cè)^[3]

1.儀器與藥品

高效液相色譜儀：島津NexeraXR，泵：LC-20ADXR，自動(dòng)進(jìn)樣器：SIL-20ACXR，柱溫箱：CTO-20A。質(zhì)譜儀：ABSCIEXAPI4000，離心機(jī)：ThermoSORVALLST8R。

對(duì)羥基苯丙氨酸購(gòu)自中檢所，同位素內(nèi)標(biāo)液L-對(duì)羥基苯丙氨酸-D2購(gòu)自于TLC公司。

2.色譜檢測(cè)條件

色譜柱：ThermoC183um（2.1×100mm）色譜柱，流動(dòng)相A相為0.1%（v/v）的甲酸，B相為乙腈，流速為0.2-0.3ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣體積5ul。

3.儲(chǔ)備液的制備

對(duì)羥基苯丙氨酸儲(chǔ)備液的制備：稱量對(duì)羥基苯丙氨酸10mg，用電動(dòng)移液器加入超純水使有效濃度為1mg/ml，標(biāo)記為stock1。

L-對(duì)羥基苯丙氨酸-D2儲(chǔ)備液的制備：稱量L-對(duì)羥基苯丙氨酸-D210mg，用電動(dòng)移液器加入超純水使有效濃度為1mg/ml，標(biāo)記為stock2。

4.標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的制備

將儲(chǔ)備液stock1用超純水逐級(jí)稀釋到2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，1ng/ml，分別取上述各濃度溶液190ul，加入儲(chǔ)備液Stock210ul，混合均勻，得到對(duì)羥基苯丙氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

5.待測(cè)尿液樣本的制備

取人體尿液樣本1ml，1500×g/min離心10-15min，取上清液，稀釋50倍，過(guò)0.22um微孔濾膜，取190ul濾液加入10ul儲(chǔ)備液Stock2，混合均勻。

6.線性分析

取步驟4獲得的對(duì)羥基苯丙氨酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液進(jìn)行液相質(zhì)譜檢測(cè)，采用液相色譜-質(zhì)譜儀連用進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)羥基苯丙氨酸的色譜檢測(cè)條件為步驟2所述條件。以標(biāo)準(zhǔn)曲線中校正濃度理論值為橫坐標(biāo)，以對(duì)羥基苯丙氨酸與同位素內(nèi)標(biāo)的面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析?；貧w曲線方程為y=4.31e+003x+1.53e+004（r=0.9991），權(quán)重系數(shù)為1/x2。

7.待測(cè)尿液樣本檢測(cè)

選取步驟5制備的尿液樣本200份進(jìn)行液相質(zhì)譜檢測(cè)，采用液相色譜-質(zhì)譜儀連用進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果帶入步驟6的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到尿液樣本中對(duì)羥基苯丙氨酸含量。其中最大值為39407ng/ml；最小值為1260ng/ml；均值為11088ng/ml，陽(yáng)性率為6%。

主要參考資料

[1] 黃學(xué)梅, 吳立翔, 呂自蘭, 李影, & 郭變琴. . 尿液對(duì)羥基苯丙氨酸檢測(cè)在惡性腫瘤早期預(yù)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床(16), 40-42.

[2] 徐衛(wèi)益, 許青, & 陳保德. (2016). 尿液對(duì)羥基苯丙氨酸水平在癌癥篩選中的應(yīng)用研究. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(21), 2967-2969.

[3] 王新宇. . 對(duì)羥基苯丙氨酸（酪氨酸）尿液檢測(cè)在乳腺腫瘤診療中的應(yīng)用. (Doctoral dissertation, 吉林大學(xué)).