> CAS號(hào)數(shù)據(jù)庫(kù) > 60-12-8 > 60-12-8/《合成生物學(xué)》期刊 | 姜岷，信豐學(xué)等：2-苯乙醇生物合成的研究進(jìn)展
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2-苯乙醇（2-PE）是一種具有玫瑰花香味的脂肪醇，因其具有溫和的、淡雅的玫瑰花般的氣味，被認(rèn)為是食品和化妝品工業(yè)中的重要香料成分。此外，它還可被用作合成其他香料或藥物化合物的底物，如苯乙酸、苯乙醛和乙酸苯乙酯等。在自然界中，2-PE主要從玫瑰、茉莉花、番茄和蕎麥等花卉和植物組織的精油中提取。然而，由于這些植物中的2-PE濃度非常低，因此萃取過程非常復(fù)雜，并且花卉的收獲也會(huì)受到天氣、植物病害和貿(mào)易限制等因素的影響。從玫瑰或其他植物的精油中提取天然2-PE的成本非常高，如提取天然2-PE的原料玫瑰精油國(guó)際市場(chǎng)的價(jià)格就已高達(dá)3500~6000美元/kg。所有這些因素都是導(dǎo)致天然2-PE的供應(yīng)不足和成本過高的主要原因。
目前，全球市場(chǎng)上2-PE的年產(chǎn)量已經(jīng)超過10 000 t，其主要生產(chǎn)方法是苯-環(huán)氧乙烷合成法和氧化苯乙烯加氫法，國(guó)際市場(chǎng)上苯-環(huán)氧乙烷合成法產(chǎn)品占40%，氧化苯乙烯加氫法產(chǎn)品占60%。苯-環(huán)氧乙烷合成法生產(chǎn)的產(chǎn)品所含微量雜質(zhì)不同，香氣差異較大，大多不能用于香料，國(guó)內(nèi)主要采用氧化苯乙烯加氫法?；瘜W(xué)合成過程一般在高溫、高壓、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境等惡劣條件下操作，會(huì)產(chǎn)生許多不良副產(chǎn)物，如乙苯、苯乙烯等，這不僅增加了下游成本，而且嚴(yán)重降低了2-PE的級(jí)別。對(duì)環(huán)保工藝日益增長(zhǎng)的需求以及消費(fèi)者對(duì)“天然”產(chǎn)品的偏好極大地刺激了香料和香料生物生產(chǎn)工藝的發(fā)展。許多具有2-PE生產(chǎn)能力的野生型菌株已經(jīng)被分離并鑒定，其中大多數(shù)是真核生物，包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）等。然而，除了葉微桿菌（Microbacterium foliorum）、變形桿菌（Proteus vulgaris）和嗜冷桿菌（Psychrobactersp.）外，很少有原核生物可以合成2-PE。生物轉(zhuǎn)化過程通常在溫和的條件下進(jìn)行，產(chǎn)物選擇性高。此外，根據(jù)美國(guó)食品和藥物管理局以及相關(guān)的歐洲法規(guī)規(guī)定，如果用于生產(chǎn)過程的底物是天然的，則生物生產(chǎn)的2-PE會(huì)被認(rèn)為是“天然的”。目前，利用生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)2-PE已取得重大突破。其中，合成生物學(xué)著力于構(gòu)建“非自然存在下的生化系統(tǒng)”，通過利用不同的生物元件，構(gòu)建全新的菌株代謝網(wǎng)絡(luò)，從而高效合成人類需求的代謝產(chǎn)物。通過使用有效的代謝工程策略可以調(diào)節(jié)不同酶的基因表達(dá)水平，以找到最佳平衡，進(jìn)而改善代謝通量并減少代謝負(fù)擔(dān)或其他副作用，從而將廉價(jià)的葡萄糖或苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為高附加值的2-PE。本文作者全面綜述2-PE合成的各種途徑、調(diào)控機(jī)制以及提高2-PE產(chǎn)量的策略。同時(shí)，討論了農(nóng)工廢棄物作為2-PE生產(chǎn)原料的利用和原位產(chǎn)物分離（ISPR）技術(shù)的應(yīng)用。
目前，2-PE的生物合成主要有3種途徑（圖1）。其中，艾氏途徑是最重要的途徑，在氮限條件下，L-苯丙氨酸（L-Phe）通過三步酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為2-PE。第2個(gè)途徑是莽草酸途徑，它是以葡萄糖等碳水化合物為底物從頭合成2-PE。然而，這種復(fù)雜的反應(yīng)途徑具有強(qiáng)烈的反饋抑制作用，導(dǎo)致2-PE生產(chǎn)效率低下。最后一種是苯乙胺途徑，它與艾氏途徑類似，在植物中起著更重要的作用。
圖1 2-苯乙醇的生物合成途徑
EMP—糖酵解途徑；HMP—磷酸戊糖途徑；AT—轉(zhuǎn)氨酶；PDC—苯丙酮酸脫羧酶；ADH—醇脫氫酶；AAAD—芳香族氨基酸脫羧酶；MAO—單胺氧化酶；PAAS—苯乙醛合酶
艾氏途徑廣泛存在于各種微生物中，它負(fù)責(zé)將支鏈氨基酸（亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和含硫氨基酸（蛋氨酸）分解代謝成相應(yīng)的雜酸或高級(jí)醇。該途徑最初是由艾氏（Ehrlich）描述的，因此用其名字進(jìn)行命名。如圖1所示，在該途徑中，L-Phe首先被轉(zhuǎn)氨酶（ARO8，ARO9，BAT1/TWT1和BAT2/TWT2）氨基化為苯丙酮酸，然后被苯丙酮酸脫羧酶（YDR380w/ARO10，YDL080C/THI3，PDC1，PDC5和PDC6）脫羧為苯乙醛，最后通過醇脫氫酶（ADH1，ADH2，ADH3，ADH4和ADH5）或甲醛脫氫酶（SFA1）還原為2-PE。
在艾氏途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平會(huì)受到相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控和氮調(diào)控策略的調(diào)節(jié)。其中，Zn2CyS6家族轉(zhuǎn)錄激活因子ARO80是2-PE合成中最重要的調(diào)控因子之一。研究結(jié)果表明，ARO80可以與aro9和aro10的啟動(dòng)子組成性結(jié)合，在芳香族氨基酸的存在下，ARO80可以激活aro9與aro10的表達(dá)。在芳香族氨基酸作為唯一氮源的條件下，芳香族氨基酸通過氨基酸通透酶Gap1進(jìn)入細(xì)胞，Aro80接受芳香族氨基酸的誘導(dǎo)信號(hào)后與aro9和aro10基因啟動(dòng)子上的CCG重復(fù)序列結(jié)合，激活艾氏途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。除ARO80以外，與碳代謝有關(guān)的鋅簇蛋白CAT8同樣是艾氏途徑中一個(gè)重要的激活因子，它在調(diào)節(jié)受芳香醇影響的基因（如Adh2）的差異表達(dá)中起著重要作用。同時(shí)，CAT8的表達(dá)還會(huì)受到具有兩個(gè)Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子MIG1的調(diào)控，CAT8的過表達(dá)或MIG1的缺失可以有效增加aro9和aro10的轉(zhuǎn)錄，從而使更多的苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為苯乙醛。
此外，艾氏途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)水平也會(huì)受到氮源種類的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中存在優(yōu)選氮源（銨或天冬酰胺）時(shí)，氮分解代謝物阻抑（NCR）的全局氮調(diào)控會(huì)嚴(yán)重限制酵母使用非優(yōu)選氮源（亮氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和脯氨酸）的能力。從分子生物學(xué)的角度來看，目前已經(jīng)鑒定出4個(gè)可以影響NCR敏感基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的GATA因子，其中包括兩個(gè)激活因子（Gln3和Gat1/Nil1）以及兩個(gè)阻遏因子（Dal80/Uga43和Gzf3/Nil2/Deh1）。當(dāng)優(yōu)選氮源存在時(shí)，Gln3和Gat1被隔離在細(xì)胞質(zhì)中，無法參與靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。當(dāng)無優(yōu)選氮源存在時(shí)，Gln3和Gat1就會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，從而激活NCR敏感基因的表達(dá)［圖2(a)］。另外，Gln3還會(huì)受到pr病毒樣URE2蛋白的負(fù)調(diào)控，攜帶失活URE2的細(xì)胞即使在優(yōu)選氮源存在時(shí)也能夠利用非優(yōu)選氮源。此外，雷帕霉素也可以影響到氮調(diào)控，經(jīng)過雷帕霉素處理可以模擬氮饑餓環(huán)境，從而導(dǎo)致Gln3和Gat1的核定位和NCR敏感基因的激活。研究表明，影響艾氏途徑中關(guān)鍵酶表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)和NCR調(diào)節(jié)呈現(xiàn)復(fù)雜的互補(bǔ)調(diào)節(jié)和部分自身調(diào)節(jié)，ARO80是ARO80靶啟動(dòng)子招募GATA因子所必需的，而GATA因子也可通過氨基酸通透性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控間接影響ARO80的活性，兩者之間相互協(xié)作共同調(diào)控艾氏途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)。此外，芳香醇的合成還會(huì)受到細(xì)胞密度的正反饋調(diào)節(jié)。一般來說，由于芳香醇是群體感應(yīng)分子，可以使酵母在氮饑餓的情況下轉(zhuǎn)變?yōu)榻z狀體，因此高密度的細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞可以產(chǎn)生更多的芳香醇。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，在高細(xì)胞密度時(shí)，aro9和aro10的轉(zhuǎn)錄水平顯著增強(qiáng)。圖2(b)顯示了通過艾氏途徑合成2-PE的總體調(diào)控圖，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
圖2 苯乙醇生物合成的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控
（Gap1/Wap1/Agp1/Bap2/Bap3/Tat2—氨基酸通透酶；ARO9/ARO8/Bat1/Twt1/Bat2/TwT2—轉(zhuǎn)氨酶；ARO10/PDC1/PDC5/PDC6/THI3—苯丙酮酸脫羧酶；Adh1/2/3/4/5—醇脫氫酶；Sfa1—醛脫氫酶）
莽草酸/苯丙酮酸途徑是酵母等微生物中從頭合成2-PE的途徑。該途徑將碳水化合物代謝與芳香族化合物合成聯(lián)系起來，其中包括3種芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）和其他芳香族次級(jí)代謝物。首先葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑被轉(zhuǎn)化為磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸赤蘚糖，這兩種物質(zhì)再經(jīng)過4步酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為莽草酸，接著莽草酸經(jīng)過代謝轉(zhuǎn)化為苯丙酮酸。苯丙酮酸隨后如艾氏途徑所述（圖1）通過脫羧和脫氫被轉(zhuǎn)化為2-PE。米曲霉、馬克思克魯維酵母和釀酒酵母等均表現(xiàn)出具有利用葡萄糖合成2-PE的能力，但是由于其生物合成途徑復(fù)雜，代謝支路多且存在多種反饋抑制因子，2-PE的產(chǎn)量很低。在最佳生長(zhǎng)條件下，芳香族氨基酸的胞內(nèi)濃度足以使苯丙氨酸和酪氨酸敏感的同工酶基本上失活。因此，尋找能夠增加L-Phe或苯丙酮酸池的優(yōu)質(zhì)菌株是提高利用莽草酸途徑合成2-PE效率的關(guān)鍵。
苯乙胺途徑是與艾氏途徑相類似的途徑，該途徑首先是在釀酒酵母和米曲霉中得到研究。在該途徑中，L-Phe首先被脫羧成苯乙胺，然后被氧化脫氨成苯乙酸，最后被還原成2-PE（圖1）。苯乙胺途徑在諸如番茄等植物中起著非常重要的作用。并且，在矮牽?；ê兔倒寤ò曛幸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了該途徑的替代方法，其中L-Phe可以通過苯乙醛合酶（PAAS）一步轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-苯乙醛。所有這些天然途徑的研究與發(fā)現(xiàn)為構(gòu)建基因工程菌株提供了有效酶的良好來源。
培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對(duì)2-苯乙醇的合成影響很大。為提高2-苯乙醇生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，研究人員對(duì)菌種誘變選育、基因編輯、培養(yǎng)基組成優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化等常規(guī)策略進(jìn)行了廣泛研究，并取得了很大進(jìn)展。
2-苯乙醇可由許多微生物進(jìn)行合成。然而，由于其產(chǎn)量仍然太低，現(xiàn)在并不適合于工業(yè)化生產(chǎn)。但是對(duì)于艾氏途徑和莽草酸途徑的研究為利用基因編輯等技術(shù)提高2-PE的產(chǎn)量提供了廣闊的前景。例如：通過過量表達(dá)ARO8和ARO10，S. cerevisiaeS288在培養(yǎng)60 h后可以合成2.61 g/L 2-PE，比原始菌株高出36.8%。為了加快L-Phe在釀酒酵母中的轉(zhuǎn)運(yùn)速度，Chen等通過過量表達(dá)MT2和S. cerevisiaeYS58來源的Gap1基因來提高芳香族氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)水平，2-PE產(chǎn)量分別增加了26.5%和25.3%。此外，ARO80、GLN3、GAT1和CAT8等全局調(diào)控因子的引入，使2-PE產(chǎn)量分別顯著增加58%、34.7%、30.6%和62%。最近，在最佳發(fā)酵條件下，一個(gè)由L-Phe轉(zhuǎn)運(yùn)體Gap1、轉(zhuǎn)氨酶ARO8、苯丙酮酸脫羧酶ARO10、醇脫氫酶ADH2和谷氨酸脫氫酶GDH2組裝而成的人工構(gòu)建菌株S. cerevisiaeYS58（G1-A8-A10-A2）-GDH在5 L發(fā)酵罐中的2-PE合成產(chǎn)量達(dá)到6.3 g/L（轉(zhuǎn)化率為95%），顯示出2-PE產(chǎn)業(yè)化的良好前景。
除艾氏途徑外，利用莽草酸途徑從頭合成2-PE同樣具有重要意義。Aoki和Uchida獲得了一株經(jīng)過化學(xué)誘變處理的突變株Z. rouxiiNISL3355，使2-PE產(chǎn)量提高了約38倍。類似地，Kim等獲得了一株馬克思克魯維酵母的抗苯丙氨酸類似物（對(duì)氟苯丙氨酸）抗性突變體，該突變體在不添加L-Phe的情況下從20 g/L葡萄糖中可以產(chǎn)生1.3 g/L 2-PE。相比于傳統(tǒng)的誘變選育等方法，通過基因工程改造對(duì)于2-PE的合成則更加有效。最近，Daran等在釀酒酵母中過量表達(dá)ARO4、ARO7、3ABP、TKL1、ARO10、PYK1D146N、EcaroL、ARO3K222L，并敲除aro3和aro8，最終使得2-PE的產(chǎn)量達(dá)到1.59 g/L。類似地，Xu等通過過量表達(dá)ylPAR4、ylARO10、ylARO7、ylPHA2、scARO7G141S，并敲除ylPYK，使得Y. lipolyticaYL35以葡萄糖為底物可以合成2.42 g/L 2-PE，為目前利用莽草酸途徑合成2-PE的最高產(chǎn)量。
雖然酵母具有天然的2-PE合成途徑，但發(fā)酵過程通常很長(zhǎng)（2~4 d），這增加了設(shè)備成本和能源消耗，進(jìn)一步限制了工業(yè)化的可擴(kuò)展性。因此，除了酵母以外，大腸桿菌也取得了重大突破。由于艾氏途徑不完整，野生的大腸桿菌無法合成2-PE，通過引入玫瑰來源的PAAS基因，經(jīng)過發(fā)酵48 h該克隆菌株可以產(chǎn)0.34 g/L 2-PE。Guo等在大腸桿菌MG1655中共表達(dá)aro8、KDC和yigB使2-PE的產(chǎn)量增加到0.28 g/L。同樣的，Atsumi等通過在大腸桿菌BW25113中共表達(dá)kivD和ADH2也獲得了類似的結(jié)果，2-PE產(chǎn)量最終可以達(dá)到0.88 g/L。在艾氏途徑中，提高還原力NAD(P)H是合成2-PE的一個(gè)重要因素。在全細(xì)胞轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，Hwang等將來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶引入大腸桿菌，通過氧化葡萄糖來促進(jìn)NAD(P)H的再生，從而使2-PE的產(chǎn)量提高了3倍。在另一項(xiàng)研究中，將來源于枯草芽孢桿菌的谷氨酸脫氫酶在大腸桿菌BW25113（31G）中過表達(dá)，以加速還原力的再生，最終工程菌株的2-PE產(chǎn)量提高了250%。為了改善輔因子與還原力不足的問題，Wang等開發(fā)了一種輔因子自給自足的系統(tǒng)，將谷氨酸脫氫酶與轉(zhuǎn)氨酶和乙醇脫氫酶偶聯(lián)，可同時(shí)再生共底物（2-酮酸）和氧化還原力[NAD(P)H]，最終使生物催化效率提高了3.8倍。和酵母一樣，大腸桿菌同樣擁有莽草酸途徑，通過引入一條從L-Phe到2-PE的路線，可以使其利用葡萄糖從頭合成2-PE。Guo等通過過量表達(dá)aroGfbr、pheAfbr、kdc、yjgB和aro8等基因，最終獲得可以利用葡萄糖合成1016 mg/L 2-PE的工程菌株DG02。Koma等在大腸桿菌中進(jìn)一步引入了T7啟動(dòng)子來增強(qiáng)Azospirillum brasilense來源的苯丙酮酸脫羧酶基因（ipdC）和Lactobacillus brevis來源的乙醇脫氫酶基因（adhC）的表達(dá)，同時(shí)敲除內(nèi)源的苯乙醛脫氫酶基因（feaB）。該工程菌株最終利用葡萄糖合成7.7 mmol/L（0.94 g/L）2-PE。Kang等優(yōu)化了莽草酸途徑中4種關(guān)鍵酶aroFfbr、pheAfbr、kdc和adh1的協(xié)同表達(dá)，重組大腸桿菌可以利用葡萄糖合成285 mg/L 2-PE。
生物轉(zhuǎn)化在2-PE生產(chǎn)中顯示出廣闊的前景。然而，和其他醇類物質(zhì)一樣，高濃度的2-PE對(duì)微生物細(xì)胞有一定的毒性，當(dāng)發(fā)酵液中的2-PE濃度達(dá)到一定程度時(shí)，就會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)，而且2-PE和乙醇聯(lián)合作用產(chǎn)生的毒性比它們各自產(chǎn)生的毒性作用累加要高。2-PE的抑菌作用機(jī)理很復(fù)雜，但通常認(rèn)為主要是由其物化特性引起，而不是對(duì)特定受體的抑制。抑制作用的主要部位可能是原生質(zhì)膜，影響糖類和氨基酸運(yùn)輸系統(tǒng)，此外，由于膜的通透性增加，加速了離子和小分子代謝產(chǎn)物跨膜向胞外擴(kuò)散，擾亂了跨膜質(zhì)子電勢(shì)。因此，該特性導(dǎo)致的生產(chǎn)力受限仍然是一個(gè)顯著的瓶頸，這促使研究人員去尋求性能更優(yōu)的菌株。商業(yè)上用于從葡萄糖生產(chǎn)甘油的菌株Candida glycerinogenesWL2002-5表現(xiàn)出4 g/L的高2-PE耐受性。利用該菌株通過分批發(fā)酵可以產(chǎn)生5 g/L 2-PE，是目前使用野生型菌株合成2-PE的最高產(chǎn)量。另外，2-PE的生產(chǎn)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了與隨機(jī)突變相結(jié)合的巨大進(jìn)展。例如，經(jīng)過紫外線輻射處理后，S. cerevisiaeCWY13210的突變菌株與原始菌株相比，2-PE耐受性和產(chǎn)量分別提高了50%和9.1%。同樣，通過紫外線照射獲得的S. cerevisiaeBD-25-39突變體可以合成5.4 g/L 2-PE，比原始菌株提高10.2%。值得注意的是，由于2-PE具有親脂性，仍然難以完全消除其所引起的毒性。因此，仍然需要更有效的誘變和篩選方法。此外，引入一些耐受性因子，例如與膜相關(guān)的熱休克蛋白HSP12，可以保護(hù)脂質(zhì)體膜的完整性，避免其受到不利環(huán)境的影響。
在工業(yè)發(fā)酵過程中，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分對(duì)于代謝產(chǎn)物的效價(jià)和產(chǎn)率至關(guān)重要。如上所述，氮源的利用遵循特定的順序。因此，L-Phe總是作為唯一氮源來激活艾氏途徑。但是，少量的有機(jī)氮源，如酵母提取物則有利于細(xì)胞生長(zhǎng)而不抑制艾氏途徑。有趣的是，Barbosa等發(fā)現(xiàn)，通過添加少量無機(jī)氮源，如磷酸二銨（DAP），可顯著減少乙醇和乙酸的形成，并增加2-PE的產(chǎn)量。這可能是由于氮源的加入促進(jìn)了NADH的再生，但其機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。碳源的主要功能是維持菌株生長(zhǎng)并提供必要的輔因子，如2-酮酸和NADH。一般情況下，隨著碳源的增加，2-PE的產(chǎn)量也會(huì)增加，但這種提高是有限的。此外，不同的碳源可以改變L-Phe的消耗百分比、2-PE和2-苯乙基衍生物的摩爾產(chǎn)率。通過與果糖、蔗糖、麥芽糖和糖蜜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)葡萄糖是S. cerevisiaeCWY132合成2-PE的最適碳源。但是為了降低成本，廉價(jià)的碳源（如粗甘油和其他工業(yè)廢料）則具有更好的價(jià)值。此外，維生素和礦物質(zhì)對(duì)生產(chǎn)2-PE也有很大影響。例如，與初始條件相比，K. marxianusCBS 600在發(fā)酵條件優(yōu)化后需要的維生素劑量是初始條件的80倍，這表明在生物轉(zhuǎn)化條件下優(yōu)化后的代謝壓力更大。在惡劣條件下，Ca2+和Mg2+都可以通過增加膜穩(wěn)定性來保護(hù)細(xì)胞。當(dāng)MgSO4添加量增加到0.4 g/L時(shí)，2-PE產(chǎn)量提高了1.65倍。當(dāng)KH2PO4增加到6 g/L時(shí)，2-PE的產(chǎn)量也出現(xiàn)了類似的增加。
一般來說，香料的合成過程對(duì)培養(yǎng)溫度非常敏感。高溫可以增強(qiáng)一些與酒精產(chǎn)生有關(guān)的酶的表達(dá)，如BAT1/2。然而，超過最佳溫度范圍，醇類的生成量將顯著降低。以釀酒酵母為例，當(dāng)培養(yǎng)溫度從30 ℃增加到40 ℃時(shí)，2-PE產(chǎn)量下降到1/3~1/23。在20~35 ℃的培養(yǎng)溫度下，L-Phe的消耗量在80.5%~90.1%之間變化；當(dāng)溫度升高到40 ℃時(shí)，L-Phe的消耗量顯著降低21.9%。除了溫度之外，pH也會(huì)通過影響酶活性從而影響芳香物質(zhì)的產(chǎn)量和成分。艾氏途徑中的關(guān)鍵酶如ARO8和ARO9是堿性上調(diào)的，而ARO10則是相反的堿性下調(diào)；因此，需要采用折中的pH來平衡整個(gè)艾氏途徑。此外，pH也會(huì)改變基質(zhì)的離子狀態(tài)，影響吸附劑對(duì)2-PE的吸附容量。在以氨基酸為唯一氮源且葡萄糖受限的有氧條件下，氨基酸主要轉(zhuǎn)化為雜酸。然而，在厭氧條件下，氨基酸幾乎完全轉(zhuǎn)化為雜醇。雜酸（和雜醇）的分布與培養(yǎng)條件密切相關(guān)。基于此，Tian等在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入了一些抗壞血酸以提高系統(tǒng)的還原水平，抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生。在這一改良系統(tǒng)中生產(chǎn)的2-PE與標(biāo)準(zhǔn)2-PE樣品表現(xiàn)出最接近的香氣相似性。
除培養(yǎng)條件外，發(fā)酵方式對(duì)2-PE產(chǎn)量也有影響。據(jù)文獻(xiàn)記載，2-PE的合成過程與細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)，當(dāng)葡萄糖濃度超過一定水平時(shí)，在有氧條件下會(huì)產(chǎn)生大量乙醇。乙醇的積累對(duì)2-PE的產(chǎn)生有很大的協(xié)同抑制作用。為了防止發(fā)酵過程中產(chǎn)生比1 g/L高的乙醇，Rong等利用活性干酵母生產(chǎn)2-PE。在該體系中，酵母降解乙醇以提供還原力NADH，最終可以利用8 g/L的L-Phe合成7.6 g/L的2-PE。
鑒于培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對(duì)2-PE生產(chǎn)的影響，需要進(jìn)行更合理的優(yōu)化研究。近年來，統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如單因素優(yōu)化、遺傳算法、Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)、響應(yīng)面法等已被廣泛使用（表1）。Etschmann等利用遺傳算法優(yōu)化了13種培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)溫度，最終，利用K. marxianusCBS 600將2-PE的產(chǎn)量提高了87%。Mei等采用單因素、正交設(shè)計(jì)、Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化，利用S. cerevisiaeBD將2-PE的產(chǎn)量由1.19 g/L提高到4.18 g/L。統(tǒng)計(jì)方法的采用不僅減少了工作量，而且評(píng)估了多個(gè)參數(shù)之間的相互作用，特別是在利用復(fù)雜的農(nóng)產(chǎn)工業(yè)廢物方面。例如，當(dāng)Plackett-Burman設(shè)計(jì)、steepest ascent設(shè)計(jì)和Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)合起來優(yōu)化可發(fā)酵培養(yǎng)物的培養(yǎng)基成分、酸堿度和發(fā)酵時(shí)間時(shí)，2-PE產(chǎn)量提高了3.3倍。
表1 基于統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)的2-PE發(fā)酵工藝優(yōu)化
農(nóng)業(yè)和工業(yè)廢物被認(rèn)為是復(fù)雜碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)存庫(kù)。將這些廢物生物轉(zhuǎn)化為增值產(chǎn)品，如2-PE，不僅可以防止廢物處置造成的環(huán)境污染，還可以增加經(jīng)濟(jì)價(jià)值。例如，葡萄含有復(fù)雜的成分，包括糖、有機(jī)酸、酚類化合物、蛋白質(zhì)、維生素等，當(dāng)使用它作為碳源并供應(yīng)5 g/L L-Phe時(shí)，利用K. marxianusCBS 6556可以合成0.77 g/L 2-PE。糖蜜是一種眾所周知的工業(yè)廢料，富含混合糖和微量元素。當(dāng)使用甜菜糖蜜作為碳源并添加7 g/L L-Phe時(shí)，利用K. marxianusCBS 600 可以合成0.89 g/L 2-PE。在使用K. marxianusATCC 10022進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)，以L-Phe及干燥的固體甘蔗渣為原料可合成2-PE 10.2 mg/g 。當(dāng)在甘蔗糖蜜廢水中添加6 g/L L-Phe時(shí)，使用微生物混合培養(yǎng)物可獲得0.99 g/L 2-PE。另外，季也蒙畢赤酵母、發(fā)酵單胞菌和釀酒酵母等都可以利用乳清培養(yǎng)基通過分批發(fā)酵的方式合成1.17~3.28 g/L 2-PE。煙草廢料是一種眾所周知的可再生資源，因?yàn)樗胸S富的芳香族化合物，是合成香料的潛在前體。在不添加任何L-Phe的情況下使用釀酒酵母可以從39.28 g/L煙草廢料和10 g/L葡萄糖中產(chǎn)生1.55 g/L 2-PE。此外，木薯廢水、番茄、辣椒渣等也都含有豐富的碳水化合物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，為2-PE的生產(chǎn)提供了可替代的底物。然而，應(yīng)該指出的是，由于這些農(nóng)用工業(yè)廢物中成分復(fù)雜且未知，2-PE的產(chǎn)量仍然很低且不穩(wěn)定。
香料生產(chǎn)的瓶頸之一是由于其疏水特性會(huì)使得脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)成為優(yōu)先結(jié)合的目標(biāo)，導(dǎo)致跨膜梯度的崩潰，從而喪失細(xì)胞活力。不同的微生物對(duì)于香料的細(xì)胞毒性表現(xiàn)出不同的耐受水平。例如，2.0 g/L外源2-PE可以完全抑制馬克思克魯維酵母的生長(zhǎng)；而釀酒酵母則可以耐受高達(dá)4 g/L的2-PE。為了減輕細(xì)胞毒性增加2-PE的產(chǎn)量，有機(jī)溶劑萃取、疏水吸附、有機(jī)滲透汽化、環(huán)糊精（CDs）絡(luò)合和超臨界CO2萃取等ISPR技術(shù)已被廣泛用于去除發(fā)酵液中的2-PE。表2列舉了已發(fā)表文獻(xiàn)中關(guān)于原位產(chǎn)物分離（ISPR）技術(shù)在2-PE生產(chǎn)中的應(yīng)用。
表2 用于2-PE生產(chǎn)的不同的原位產(chǎn)物分離（ISPR）技術(shù)
液-液萃取法（LLE）采用有機(jī)溶劑從有機(jī)相中連續(xù)提取疏水產(chǎn)物，因其簡(jiǎn)單、廉價(jià)、易擴(kuò)展等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于香精生產(chǎn)。例如，當(dāng)使用油酸作為萃取劑時(shí)，使用釀酒酵母可以獲得12.6 g/L 2-PE，與沒有使用提取技術(shù)相比，2-PE的含量增加了8.6 g/L。用油醇作為萃取劑，使K. marxianusCBS 600的2-PE產(chǎn)量提高了3倍。此外，聚丙二醇1500和1200 （PPG 1500和PPG 1200）等高分子萃取劑在2-PE分離中同樣表現(xiàn)出良好的萃取性能。在以PPG 1500為萃取劑的補(bǔ)料分批發(fā)酵中，萃取劑中的2-PE濃度超過22 g/L，總濃度達(dá)到7.5 g/L。當(dāng)以PPG 1200為萃取劑時(shí)，有機(jī)相中2-PE含量為26.5 g/L，2-PE Ac含量為6.1 g/L，2-PE總質(zhì)量濃度達(dá)到10.5 g/L。
在液-液萃取中，發(fā)酵液被泵入抽提裝置以連續(xù)回收2-PE[圖3(a)]。2-PE生產(chǎn)可以得到顯著改善，但仍存在一些缺陷。首先，有機(jī)溶劑會(huì)對(duì)細(xì)胞活力和代謝活性造成嚴(yán)重的毒性。因此，理想的萃取劑應(yīng)具有良好的生物相容性和較高的分配系數(shù)。其次，乳狀液的形成將影響液體和溶劑相的分離。最后，也是最重要的一點(diǎn)，液-液分離系統(tǒng)中使用的有機(jī)溶劑，特別是高碳含量的有機(jī)溶劑，很難蒸發(fā)從而去除2-PE，殘留的溶劑會(huì)嚴(yán)重影響2-PE的質(zhì)量。因此，尋找合適的有機(jī)溶劑是液-液分離操作的關(guān)鍵?？紤]到2-PE的脂溶性，使用一些脂肪酸/油脂作為萃取劑可作為一種2-PE回收的方法。菜籽油首先被證實(shí)可以將2-PE的整體濃度提高2.7倍。此外，疏水中空纖維膜可以被用來阻擋催化介質(zhì)中的有機(jī)溶劑，從而避免乳狀液的形成。但需要注意的是，該膜易受污染。
近年來，不相容離子液體（ILS）因其可忽略的蒸氣壓、不可燃性和高熱穩(wěn)定性而成為綠色非有機(jī)溶劑受到越來越多的關(guān)注。通過對(duì)9種離子液體的生物相容性、分配系數(shù)（Kd）和萃取效率的綜合考察，發(fā)現(xiàn)3種基于[NTf2]?的離子液體具有很大的提高2-PE產(chǎn)量的潛力。使用基于[NTf2]?的ILS，觀察到2-PE的總產(chǎn)量增加了3.5倍。此外，[NTf2]?、[TCM]?和[TCB]?基離子液體可以有效地從水相中回收2-PE。
圖3 應(yīng)用于2-PE生產(chǎn)中的ISPR技術(shù)
為了進(jìn)一步提高萃取效率，研究了一種液-固萃取系統(tǒng)（LSE）。在這個(gè)系統(tǒng)中，有機(jī)溶劑被包裹到聚合物基質(zhì)中，這不僅解決了微生物毒性和乳狀液的問題，而且還簡(jiǎn)化了下游的加工過程[圖3(b)]。將癸二酸二丁酯包埋在聚乙烯的聚合物基質(zhì)中后，不僅沒有形成乳狀液，2-PE的產(chǎn)率還提高了1倍。通過將癸二酸二丁酯嵌入到海藻酸鹽微膠囊中，設(shè)計(jì)了一條將LSE體系與膜工藝相結(jié)合的新工藝。在該體系中，不會(huì)形成乳狀液，使用S. cerevisiaeGIV2009，最終2-PE濃度提高到5.6 g/L，比使用單相時(shí)提高了1.8 g/L。雖然LSE的性能優(yōu)于LLE，但溶劑固定化會(huì)增加成本，使生產(chǎn)過程復(fù)雜化。
原位產(chǎn)物吸附（ISPA）是一種常見的ISPR技術(shù)，它使用樹脂或其他吸附介質(zhì)來避免底物或產(chǎn)物的抑制[圖3(c)]。ISPA因其操作相對(duì)簡(jiǎn)單、易放大、對(duì)有毒物質(zhì)不敏感、易于再生和成本低而被廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)過程。為了回收2-PE，人們研究了各種樹脂。非極性大孔樹脂D101對(duì)2-PE的吸附能力較強(qiáng)，對(duì)L-Phe的吸附能力較低。在添加2 g/L水合樹脂D101的條件下，S. cerevisiaeBD可獲得6.17 g/L 2-PE產(chǎn)量。當(dāng)使用7%（干重）的交聯(lián)聚苯乙烯樹脂HZ818時(shí)，用S. cerevisiaeP-3從12 g/L L-Phe中得到6.6 g/L 2-PE，摩爾產(chǎn)率為0.744，比對(duì)照提高了66.2%。當(dāng)大孔樹脂F(xiàn)D 0816作為連續(xù)生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的吸附劑時(shí)，摩爾產(chǎn)率最高，為0.90。然而，樹脂對(duì)2-PE的吸附容量很低，而且吸附過程受發(fā)酵液的影響很大。該文對(duì)幾種聚合物吸附劑進(jìn)行了測(cè)試，以確定具有較高選擇性的吸附劑。例如：將Hytrel?8206應(yīng)用于固-液兩相分離生物反應(yīng)器系統(tǒng)，在3 L的發(fā)酵體積內(nèi)可獲得13.7 g/L 2-PE。當(dāng)采用半連續(xù)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)時(shí)，2-PE的最高濃度為20.4 g/L，水相為1.4 g/L，聚合物相為97 g/L。
5.4.1 有機(jī)滲透汽化
滲透汽化是一種膜分離過程，在膜分離過程中，一層致密的無孔膜將液體溶液從氣相中分離出來。在裝有聚辛基甲基硅氧烷（POMS）膜的有機(jī)滲透汽化裝置中，分批培養(yǎng)獲得了2.2 g/L和1.3 g/L的雙倍2-PE濃度。然而，這些膜很容易被污染，仍然需要探索更合適的膜材料。
5.4.2 與環(huán)糊精（CDs）絡(luò)合
CDs是具有疏水內(nèi)部和親水外部的超分子主體化合物。眾所周知，CDs及其衍生物與許多有機(jī)化合物形成包合物。在最佳條件下，β-CD對(duì)2-PE的萃取率為1 mol/mol。
5.4.3 超臨界CO2萃取
超臨界流體（SCFs）具有高吸附能力、高擴(kuò)散系數(shù)和低黏度等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于從土壤、水和沉淀物中提取有機(jī)污染物。無毒和不可燃的二氧化碳（CO2）是目前工業(yè)中使用的最流行和最便宜的超臨界流體材料。特別是超臨界CO2在玫瑰混凝土揮發(fā)油的提取過程中表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。然而，直接利用超臨界CO2萃取是不可能的，因?yàn)镃O2對(duì)細(xì)胞活力有很大的影響。因此，在提取之前進(jìn)行細(xì)胞分離是必要的。
由于植物提取的局限性和化學(xué)合成工藝的缺陷，生物合成2-PE受到越來越多的關(guān)注。雖然在機(jī)理認(rèn)識(shí)和提高2-PE效價(jià)方面取得了很大突破，但在經(jīng)濟(jì)上仍不具備工業(yè)化的可行性。為了將實(shí)驗(yàn)室研究成果轉(zhuǎn)化為工業(yè)過程，底盤菌種開發(fā)、生物過程優(yōu)化和ISPR技術(shù)設(shè)計(jì)之間的深度集成綜合開發(fā)是必要的。
在自然界中，許多真菌可以自主合成2-PE，但產(chǎn)量仍然很低。代謝工程對(duì)于改善2-PE的生產(chǎn)至關(guān)重要，它可以減輕反饋抑制，增強(qiáng)前體轉(zhuǎn)運(yùn)，提高關(guān)鍵酶活性，并干擾副產(chǎn)物的形成。通過對(duì)2-PE合成途徑的改造或引入耐受因子，選擇耐受性好、產(chǎn)2-PE能力強(qiáng)的菌株可能是獲得較好的2-PE生產(chǎn)候選菌株的唯一途徑。此外，目前對(duì)2-PE合成的調(diào)控機(jī)制還沒有進(jìn)行深入的研究。更好地理解艾氏途徑/莽草酸途徑涉及的生物化學(xué)，特別是酶及其代謝調(diào)節(jié)，是指導(dǎo)進(jìn)一步遺傳修飾的基礎(chǔ)。
培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對(duì)2-PE的生產(chǎn)有很大影響。從經(jīng)濟(jì)的角度來看，高增值產(chǎn)品的生產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量遠(yuǎn)比實(shí)際產(chǎn)量重要。然而，培養(yǎng)基成分的改變無疑會(huì)增加生物催化法合成2-PE的生產(chǎn)成本，不利于該技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。因此，進(jìn)一步研究利用農(nóng)業(yè)或工業(yè)副產(chǎn)品為主要原料，如制糖工業(yè)的副產(chǎn)品糖蜜，可以節(jié)約生產(chǎn)成本，有利于該工藝的工業(yè)化應(yīng)用。目前報(bào)道的不利用原位產(chǎn)物分離技術(shù)的2-PE最高生產(chǎn)率只有0.12 g/(L·h)，為了更好地實(shí)現(xiàn)2-PE商業(yè)化生產(chǎn)，更多的研究應(yīng)該集中在2-PE的生產(chǎn)率上。
ISPR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于2-PE生產(chǎn)中，尤其是LLE和ISPA。然而，LLE系統(tǒng)中殘留有機(jī)溶劑的去除困難限制了其應(yīng)用。與LLE相比，ISPA具有更大的工業(yè)放大潛力。在實(shí)際生產(chǎn)中，ISPR技術(shù)必定會(huì)增加生產(chǎn)過程的復(fù)雜性和成本，因此，仍需進(jìn)一步研究開發(fā)更多的高容量吸附材料運(yùn)用于完整細(xì)胞的原位產(chǎn)物分離技術(shù)，如合成聚合物。隨著生物技術(shù)和跨學(xué)科的快速發(fā)展，采用更先進(jìn)的發(fā)酵方式，如將不同的生物材料應(yīng)用到微生物發(fā)酵過程中，設(shè)計(jì)使用可以同時(shí)合成并分離2-PE的新型反應(yīng)器等，同時(shí)結(jié)合ISPR技術(shù)，使用優(yōu)質(zhì)菌株，將進(jìn)一步提高2-PE的生產(chǎn)效率。此外，對(duì)“天然”香料日益增長(zhǎng)的需求將使得利用生物法合成2-PE的商業(yè)前景更加廣闊。