59920-31-9 / α-葡萄糖苷酶的制備

背景及概述^[1]

α-葡萄糖苷酶，又稱葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（α-glucosidase,EC.3.2.1.20），系統(tǒng)命名為 α-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶。它在糖的催化反應(yīng)中具有水解和轉(zhuǎn)糖苷的雙重作用。水解作用可從α-葡萄糖苷、寡糖和葡聚糖的非還原性末端切開α-1,4糖苷鍵，釋放出葡萄糖；轉(zhuǎn)糖苷作用又可將游離出的葡萄糖殘基以α-1,6糖苷鍵轉(zhuǎn)移到另一個(gè)葡萄糖或麥芽糖類底物上，從而得到非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖（簡(jiǎn)稱IMO）。

制備^[1]

自20世紀(jì)80年代日本從黑曲霉中篩選出α-葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌種，并得以工業(yè)化生產(chǎn)酶制劑以來，α-葡萄糖苷酶在基礎(chǔ)研究和工業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮著越來越重要的作用。目前，國(guó)外生產(chǎn)的α-葡萄糖苷酶大部分為純酶，酶活較高；而國(guó)內(nèi)主要以粗酶液為主，酶活較低。而且，國(guó)內(nèi)尚未有商品化α-葡萄糖苷酶酶制劑出售，用于生產(chǎn)的酶均來自國(guó)外少數(shù)幾個(gè)酶制劑廠，進(jìn)口價(jià)格昂貴，導(dǎo)致IMO的生產(chǎn)成本居高不，一定程度上制約了我國(guó)IMO產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

選育α-葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌種并建立相應(yīng)的高效制備工藝是實(shí)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶低成本商 業(yè)化制造的關(guān)鍵所在。CN201710281060.9提供一種α-葡萄糖苷酶的高效制備方法。

以微生物或植物來源的α-葡萄糖苷酶基因堿基序列為依據(jù)，參考目標(biāo)宿主菌的密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化， 并通過采用長(zhǎng)引物和低溫易錯(cuò)PCR的篩選獲得催化性能顯著提升的α-葡萄糖苷酶編碼基因，然后再通過引入強(qiáng)啟動(dòng)子和高分泌效率信號(hào)肽等元件，借助重構(gòu)的表達(dá)質(zhì)粒增加α-葡萄糖苷酶基因拷貝數(shù)，獲得了高效分泌表達(dá)α-葡萄糖苷酶的重組菌，結(jié)合酶活力差異性篩選獲得活力最高的菌株。結(jié)合該菌株的生長(zhǎng)特征和產(chǎn)酶特征建立30m³發(fā)酵體系下的α-葡萄 糖苷酶高效分泌表達(dá)工藝。

實(shí)施例:α-葡萄糖苷酶編碼基因在畢赤酵母中的克隆和表達(dá)

以黑曲霉Aspergillus niger CICIM F0215菌株（江南大學(xué)中國(guó)高校工業(yè)微生物資源 與信息中心https://cicim-cu.jiangnan.edu.cn）為出發(fā)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌體。采用 TRNzol總RNA提取試劑提取它們的總RNA。以總RNA為模板，參照RT-PCR試劑盒說明書，以 oligo (dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。分別以染色體DNA或第一鏈cDNA為模板，使用引物（SEQ ID NO. 2～SEQ ID NO.13；相鄰的兩個(gè)為一對(duì)上下游引物）進(jìn)行PCR擴(kuò)增出α-葡萄糖苷酶的編碼基因agA、agB、agC、agD、agE和agF。

PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，61℃30 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pPIC9K分別用SnaB I和EcoRI進(jìn)行酶切、純化，再進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Escheriachia coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。用含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并提取其質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切進(jìn)行驗(yàn)證。畢赤酵母的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選：分別將構(gòu)建成功的6個(gè)重組質(zhì)粒pPIC9K-agA、pPIC9K-agB、pPIC9K-agC、pPIC9K-agD、pPIC9K-agE和pPIC9K-agF（圖4）用Sac I或Sal I進(jìn) 行單酶切線性化。

酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化Pichia pastoris GS115，均勻涂布于 MD平板，30℃恒溫培養(yǎng)至單菌落形成。挑取多個(gè)單克隆重組酵母分別接種于終濃度為0.5、2 mg/mL G418的YPD平板上進(jìn)行篩選，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑取生長(zhǎng)情況好的重 組酵母菌株保存，并分別對(duì)這6株重組菌進(jìn)行命名AGa、AGb、AGc、AGd、AGe和AGf。采用畢赤酵母操作手冊(cè)給定的培養(yǎng)方法和甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵方法制備相應(yīng)的α-葡萄糖苷酶酶液。

（1）將篩選的重組酵母菌株與對(duì)照菌株畢赤酵母GS115進(jìn)行劃線活化，挑取單菌落 分別接種到50 mL YPD液體培養(yǎng)基中（含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素），30℃、180 r/min 培養(yǎng)16～18 h；

（2）按1%接種量分別接入50 mL BMGY 液體培養(yǎng)基中（含有終濃度為50 μg/mL卡那霉 素），30℃，180 r/min培養(yǎng)至OD600=2～6 (約16～18小時(shí))；

（3）收集菌液于滅菌的50 mL離心管中，8000 r/min，離心5 min，倒掉上清，用1/5-1/10 原培養(yǎng)基體積的BMMY重懸細(xì)胞，使菌體的OD600=1進(jìn)行培養(yǎng)，加入甲醇至終濃度為0.5%進(jìn)行誘導(dǎo)，放入30℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)；

（4）發(fā)酵96小時(shí)取樣測(cè)酶活（按照前述方法進(jìn)行測(cè)定），并加入甲醇至終濃度為0.5%進(jìn)行誘導(dǎo)。測(cè)定酶活列于表1。表1重組畢赤酵母中α-葡萄糖苷酶的合成水平

主要參考資料

[1]CN201710281060.9 一種α-葡萄糖苷酶的高效制備方法