58-96-8 / 尿苷的生產(chǎn)

產(chǎn)品性質(zhì)

白色針狀結(jié)晶或粉末，無氣味，昧稍甜而微辛。系核苷類的一種，能溶于水，微溶于稀醇，不溶于無水乙醇。

用途和現(xiàn)狀^【1】

尿苷是構(gòu)成動(dòng)物細(xì)胞核酸的有關(guān)成分，能提高機(jī)體抗體水平。動(dòng)物試驗(yàn)表明尿苷和肌苷等合用能促進(jìn)心肌細(xì)胞代謝，加速蛋白質(zhì)、核酸生物合成和能量產(chǎn)生，可促進(jìn)和改善腦細(xì)胞代謝?？捎糜诰扌图t血球貧血，也可與其他核苷、堿基合用于治療肝、腦血管及心血管等疾病。

生產(chǎn)方法^【2】

發(fā)酵法生產(chǎn)尿苷(Uridine，UR)的報(bào)道，大約與發(fā)酵法生產(chǎn)胞苷的報(bào)道近乎在同一時(shí)期。20世紀(jì)80年代后期至90年代中期日本武田化學(xué)工業(yè)公司的科學(xué)家開始發(fā)表這一成果，他們共同研究嘧啶核苷發(fā)酵，每個(gè)人側(cè)重于不同的一個(gè)課題。尿苷足重要的合成藥物的中間體，抗腫瘤藥物5。氟尿嘧啶，5，氟尿嘧啶核苷，抗病毒藥物5一碘脫氧尿苷歷來都是以化學(xué)全合成制取。如以尿苷為前體經(jīng)半合成或功能基團(tuán)置換將大大降低此類藥物的生產(chǎn)成本。

以前有些報(bào)道使用大腸桿菌、沙門桿菌、產(chǎn)氨短桿菌的變異株產(chǎn)生尿苷酸或尿苷，但產(chǎn)率都不超過59／L的水平，在工業(yè)生產(chǎn)上尚不具備價(jià)值。也許是同一批人研究了尿苷和胞苷的變育種，他們使用了同一株枯草芽孢桿菌野生菌為母株(No．122)，獲得了發(fā)酵法生產(chǎn)尿苷和胞苷的成功。

(一)尿苷產(chǎn)生菌的誘變育種

1．尿苷產(chǎn)生菌母株的選育

為了獲得尿苷發(fā)酵產(chǎn)率高的菌株，一定要選擇一株嘧啶核苷酸代謝能力較強(qiáng)的菌株，或者稱核酸庫較大的菌株，按照嘧啶核苷酸生物合成代謝圖判斷，乳清酸和乳清酸核苷酸是尿苷酸生物合成的中間體。如果選育尿嘧啶缺陷型(U一)變異株則可以在發(fā)酵過程中積累乳清酸和乳清酸核苷，能大量積累這兩種產(chǎn)物的變異株一定有希望積累大量的尿苷，因?yàn)榇祟惥奏ごx途徑相關(guān)的酶活性很高，也最合適作為尿苷產(chǎn)生菌的母株。

表8一19顯示了野生型芽孢桿菌的尿嘧啶缺陷型變異株產(chǎn)生乳清酸和乳清酸核苷的情況，其中最優(yōu)秀的菌株為枯草芽孢桿菌No．122(野生型)誘變獲得的F一100(U一)產(chǎn)生的乳清酸和乳清酸核苷最高。

2．尿嘧啶缺陷型(U)的性狀

圖8—14顯示尿嘧啶缺陷型菌株AF一100在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子尿嘧啶最合適的量是50mg／L，增加量使乳清酸和乳清酸核苷二者的積累量顯著下降，這說明尿苷類化合物的生物合成受產(chǎn)物的反饋調(diào)控，要選育高產(chǎn)尿苷的菌，必須解除反饋抑制。

3．2一巰基尿嘧啶(2TU)抗性變異株產(chǎn)尿苷

選擇3種尿嘧啶結(jié)構(gòu)類似物——2一巰基尿嘧啶、6一雜氮尿嘧啶和5一氟尿嘧啶對(duì)枯草芽孢桿菌No．122(野生型)進(jìn)行生長(zhǎng)抑制反應(yīng)檢測(cè)，觀察到在基本培養(yǎng)基中添加10～10099／ml的每一種藥物即引起生長(zhǎng)抑制，而在培養(yǎng)基中含100t_tg／ml尿嘧啶時(shí)，對(duì)2。巰基尿嘧啶和6一雜氮尿嘧啶解除抑制，因此確定此兩種結(jié)構(gòu)類似物是合適的分離抗性變異株的制劑。將No．122菌株經(jīng)誘變后選育抗300／Lg／ml 2一巰基尿嘧啶的突變株，在這些突變株中選育到一株37℃80h發(fā)酵產(chǎn)尿苷109／L的抗藥性菌株No．258。

4．6一雜氮尿嘧啶抗性變異株提高尿苷產(chǎn)率

上述獲得的No．258是一株抗2TU變異株，但該菌株不能在含有l(wèi)mg／ml的6一雜氮尿嘧啶的基本培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)，它對(duì)該類似物的生長(zhǎng)反應(yīng)極敏感，因此用此菌株為出發(fā)菌，用亞硝基胍(N—methyl．N7一nitro-N—Ni哪dine)為誘變劑，選育抗不同濃度6一雜氮尿嘧啶的變異株，其中No．508變異株能夠抗5mg／ml的6一雜氮尿嘧啶，發(fā)酵產(chǎn)尿苷469／L。

5．降低尿苷磷酸化酶(Upase)變異株提高尿苷產(chǎn)率

No．508菌株與母株No．258比較，顯著提高了尿苷產(chǎn)率，但是副產(chǎn)物尿嘧啶的產(chǎn)率相差無幾，僅從79／L下降至69／L。由于副產(chǎn)物的生成不僅使尿苷對(duì)糖轉(zhuǎn)化率低，而且在工業(yè)生產(chǎn)上提取分離工藝復(fù)雜化。No．508除積累尿苷之外尚產(chǎn)生較多尿嘧啶是由于該菌株具有分解尿苷成為尿嘧啶的尿苷磷酸化酶(Upase)，為此，從No．508再經(jīng)過二次誘變和一次轉(zhuǎn)化得到一株缺乏Upase的變異株。

第一步經(jīng)誘變選育乳清酸核苷酸脫羧酶缺乏的變異株(OMP—Dcase一)，它需要尿嘧啶或尿苷維持生長(zhǎng)。第二步再誘變Upase缺乏變異株，它在提供尿苷時(shí)生長(zhǎng)很差，但在尿嘧啶提供時(shí)生長(zhǎng)很好。第三步經(jīng)轉(zhuǎn)化方法回復(fù)乳清酸核苷酸脫羧酶活性。最終獲得的No．556菌，尿苷磷酸化酶活力很低，發(fā)酵產(chǎn)生559／L的尿苷而產(chǎn)生很少量尿嘧啶，產(chǎn)物對(duì)糖轉(zhuǎn)化率34％。

(二)高產(chǎn)尿苷變異株的遺傳性狀

枯草芽孢桿菌全合成尿苷的途徑見圖8—9。在此途徑中的終產(chǎn)物尿苷酸(UMP)和尿三磷(UTP)抑制合成過程中的6個(gè)酶，尿嘧啶衍生物阻遏這6個(gè)酶經(jīng)過誘變選育抗藥性變異株后，尿苷酸調(diào)控的6個(gè)酶全部被解除了反饋抑制，而且這些酶在變異株中的活性與母株相比提高了16～30倍，而尿苷磷酸化酶只有母株的3／100，因而變異株在一個(gè)合適的發(fā)酵條件時(shí)能大量積累尿苷。變異菌株的遺傳圖譜及產(chǎn)率見表8—23。

(三)枯草芽孢桿菌尿苷產(chǎn)生菌的最適發(fā)酵條件

1．氮源的作用

尿苷是含氮化合物，無論有機(jī)氮和無機(jī)氮對(duì)菌種的生長(zhǎng)和核苷的產(chǎn)率有很大影響，現(xiàn)使用變異株No．556，37℃，80h發(fā)酵周期，基本培養(yǎng)基(g／d1)為：葡萄糖16；尿素2；CaC030．5；再添加各種有機(jī)氮。

最高尿苷產(chǎn)率的有機(jī)氮源為C．S．L 4％加C．G．M 0．7％或C．s．L 4％加酪源0．2％。在發(fā)酵全過程中，如采用自動(dòng)流加液氨控制pH7，但尿苷產(chǎn)率并不能達(dá)到最高，經(jīng)分析，必須有一個(gè)合適的銨離子濃度使尿苷產(chǎn)率達(dá)到最高。

2．碳源的作用

不同碳源的發(fā)酵試驗(yàn)和葡萄糖為碳源的濃度試驗(yàn)見表8—26，表8—27。由表8—26，表8—27看出碳源中葡萄糖對(duì)產(chǎn)尿苷最佳，初糖濃度18％，尿苷產(chǎn)率和對(duì)糖轉(zhuǎn)化率最高。

3．鈣化合物對(duì)產(chǎn)尿苷的影響

在金屬鹽試驗(yàn)中，鈣鹽如CaC03，CaCl2·2H20極大地促進(jìn)尿苷的產(chǎn)率(表8—28)，最適濃度分別是0．5％和0．3％，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)鈣鹽被分開消毒時(shí)，尿苷產(chǎn)率很低。而鈣鹽與培養(yǎng)基混合消毒，在培養(yǎng)基中沒有磷鹽時(shí)，尿苷也顯著減產(chǎn)。因此認(rèn)為鈣鹽與部分磷鹽絡(luò)合，使培養(yǎng)基中存在低濃度的磷離子水平，促進(jìn)尿苷高產(chǎn)；高濃度的磷鹽不僅菌體生長(zhǎng)慢且產(chǎn)量降低。

4．pH的影響

發(fā)酵期間控制pH6．0～8．0，對(duì)尿苷的產(chǎn)率是穩(wěn)定的，并顯現(xiàn)開始12h pH下降到6．0左右，至24h增加到7．0，以后保持不變最佳狀態(tài)(表8—30)。

5．培養(yǎng)溫度的影響

研究了32～42*(2范圍內(nèi)溫度不同對(duì)尿苷產(chǎn)率的影響，尿苷高產(chǎn)的最適發(fā)酵溫度是3812，如表8—31。

6．供氧的影響

使用No．556菌株，200L發(fā)酵罐進(jìn)行了不同供養(yǎng)對(duì)產(chǎn)生尿苷的影響，培養(yǎng)基中的溶氧值很強(qiáng)烈地影響尿苷的產(chǎn)率，在OTR為20×10_7mol／(n[1l·min)時(shí)，尿苷產(chǎn)率最高；當(dāng)OTR低于15×10。7mol／(ml·min)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)在溶氧濃度減少到0狀態(tài)時(shí)，尿苷產(chǎn)率顯著降低。

(四)高產(chǎn)尿苷發(fā)酵全過程

以抗藥性誘變育種為主要目的的枯草芽孢桿菌No．556能夠在一個(gè)合適培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量尿苷。圖8—15的過程是在6000L發(fā)酵罐裝液量為4000L，38℃，攪拌180r／min，通氣量為1500L／min時(shí)的結(jié)果。12h前從培養(yǎng)基中大量釋放出銨離子沒有尿苷產(chǎn)生，此后隨著糖、尿的消耗，幾乎是平行地產(chǎn)生尿苷直至75h，最高尿苷達(dá)659／L。

參考文獻(xiàn)

[1]衷平海，張國文主編,生物化學(xué)品生產(chǎn)技術(shù),江西科學(xué)技術(shù)出版社,2007.5,第205頁

[2]焦瑞身主編,微生物工程,化學(xué)工業(yè)出版社,2003年07月第1版,第179頁