58-61-7 / 生物樣品中腺苷的檢測方法及腺苷的藥理作用

背景及概述^[1][2]

腺苷為一天然核苷酸，是機體代謝的中間產(chǎn)物，也是體內(nèi)重要活性成分之一。腺苷做成的注射液1989年美國首次上市。腺苷(Adenosine, AD)即腺嘌呤核苷，是機體RNA的代謝產(chǎn)物，屬于生物小分子化合物，它是一種內(nèi)源性核苷，能參與血管神經(jīng)舒張活動，具有抗心律失常的功效。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，它對神經(jīng)傳遞的調(diào)節(jié)及對抵抗缺血性與疾病性神經(jīng)傷害等方面具有重要作用。同時腺苷作為腺苷脫氨酶的作用底物，其含量變化也會間接反應腺苷脫氨酶的體內(nèi)代謝水平，而腺苷脫氨酶活性的檢測對于臨床許多疾病的診斷都具有重要參考價值。

檢測方法^[1]

有研究證實，腺苷作為腫瘤的潛在生物標志物具有重要意義，尿液中腺苷含量可以被用來檢測疾病的病程。目前腺苷的檢測方法，雖然可以達到檢測要求，但是卻存在許多的缺點，例如高效液相色譜法、紫外檢測、流式檢測法及氣質(zhì)/液質(zhì)色譜法等都存在需要復雜的樣本前處理、操作費時和儀器昂貴等缺點，因此建立一種簡單、快速和高靈敏度的腺苷檢測新方法有著重要的現(xiàn)實意義。本發(fā)明提供一種生物樣品中腺苷含量的檢測方法，基于核酸適配體識別技術(shù)和離子交換信號放大機制，具有高靈敏度、準確度和精確度。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明CN201610211194.9以四氧化三鐵納米粒子（Fe3O4）為磁性分離器，碲化鎘量子點（CdTe QDs）為熒光標記，核酸適配體為腺苷分子識別器件，銀離子為離子交換反應置換離子。包括以下步驟：

步驟一、腺苷探針的制備：

（1）、表面修飾羧基的四氧化三鐵磁性納米粒子和氨基修飾的腺苷適配體1（ABA1）通過縮合反應結(jié)合；

（2）、巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點和氨基修飾的腺苷適配體2（ABA2）通過縮合反應結(jié)合；

（3）、將兩種結(jié)合產(chǎn)物以等摩爾比溶于pH 7.4的PBS緩沖溶液中形成腺苷探針；四氧化三鐵納米粒子的粒徑為8～12nm；碲化鎘量子點激發(fā)波長為370nm，發(fā)射波長為550nm；表面修飾羧基的四氧化三鐵磁性納米粒子和氨基修飾的腺苷適配體1，其摩爾比為200: 1～250:1；巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點和氨基修飾的腺苷適配體2，其摩爾比為20:1～25:1。

步驟二、腺苷探針與腺苷結(jié)合并使之從生物樣品中分離：

將腺苷加入步驟一制得的腺苷探針體系中，通過堿基配對形成腺苷三明治結(jié)構(gòu)（Fe3O4-ABA1-AD-ABA2-CdTe QDs），通過磁性分離將其從生物樣品中分離；孵育時間為30min，孵育溫度為20～40℃。

步驟三、運用銀離子與三明治結(jié)構(gòu)中的鎘離子的離子交換作用定量腺苷含量：在步驟二分離得到的腺苷三明治結(jié)構(gòu)中加入定量且相對過量的銀離子溶液，銀離子與腺苷三明治結(jié)構(gòu)中的碲化鎘量子點進行離子交換反應，取代二價鎘離子生成碲化銀沉淀并破壞原有量子點結(jié)構(gòu)，消耗了部分銀離子，其消耗含量與腺苷含量成正比。經(jīng)過離心棄去沉淀，利用碲化鎘量子點作為熒光探針，檢測出反應上清液中剩余的銀離子濃度。通過計算在加入腺苷和未加入腺苷的情況下銀離子檢測體系的熒光的比值對腺苷進行定性和定量。離子交換反應時間為20min，離子交換的反應體系為pH 7.4的PBS緩沖溶液。

本發(fā)明以腺苷適配體分別標記碲化鎘量子點與四氧化三鐵磁性納米粒子組成生物熒光探針，結(jié)合離子交換熒光信號放大技術(shù)，建立了一種簡便、快速地檢測癌癥指標物腺苷的新方法，腺苷檢測原理圖示如圖1所示：圖A中，腺苷適配體（5′-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT-3′）被切分成兩個不同的片段（ABA1和ABA2）。這兩個核酸片段沒有腺苷的存在下無法形成穩(wěn)定的DNA二聚體結(jié)構(gòu)。在加入腺苷后，這兩段核酸片段能夠結(jié)合腺苷，重新裝配成穩(wěn)定的三級結(jié)構(gòu)。利用該特點，在偶聯(lián)劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）的作用下，將羧基修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點分別與均用氨基修飾的腺苷適配體片段ABA1和ABA2通過CO-NH化學鍵結(jié)合。由于腺苷適配體ABA1和ABA2只有在腺苷的存在下才能通過堿基配對互補結(jié)合在一起，因此，如圖B所示，加入目標分子腺苷，腺苷與四氧化三鐵納米粒子連接的ABA1以及與碲化鎘量子點連接的ABA2能夠形成三明治結(jié)構(gòu)（Fe3O4-ABA1-AD-ABA2-CdTe QDs）。

通過磁性分離，將該三明治結(jié)構(gòu)從生物樣品中分離。由于碲化鎘量子點納米晶體中包含成千上萬的二價鎘離子，加入銀離子溶液作為離子交換試劑，生成的碲化銀相比于碲化鎘更具有熱力學穩(wěn)定性，因此在常溫下銀離子就能夠迅速地將三明治結(jié)構(gòu)中的鎘離子置換出來，將量子點的結(jié)構(gòu)完全破壞。因此在腺苷三明治體系中加入過量的銀離子溶液，銀離子與腺苷三明治結(jié)構(gòu)中的碲化鎘量子點進行離子交換反應，消耗了部分銀離子，其消耗含量與腺苷含量成正比。經(jīng)過離心棄去沉淀，利用碲化鎘量子點作為熒光探針，檢測出反應上清液中剩余的銀離子濃度。

由于銀離子對碲化鎘量子點有很強的熒光猝滅作用，因此熒光檢測探針碲化鎘量子點的熒光猝滅值越小，說明剩余的銀離子含量越少，則與三明治結(jié)構(gòu)中的碲化鎘量子點發(fā)生離子交換反應的銀離子含量越多，則三明治結(jié)構(gòu)中腺苷的濃度越高。因此腺苷的濃度與作為熒光探針的碲化鎘量子點的熒光淬滅值成反比。通過計算在加入腺苷和未加入腺苷的情況下銀離子檢測體系的熒光的比值對腺苷進行定量。本發(fā)明可高靈敏檢測分析目標，能夠檢測到0.210nM的腺苷，線性范圍在0.330nM～167nM，線性范圍廣。

藥理作用^[2]

腺苷為一天然核苷酸，是機體代謝的中間產(chǎn)物，也是體內(nèi)重要活性成分之一。其作用系通過激活腺苷受體(A受體)而實現(xiàn)。在心房、竇房結(jié)及房室結(jié)，腺苷通過與A受體結(jié) 合而激活G蛋白偶聯(lián)的鉀通道，使 K⁺外流增加，細胞膜超極化而降低自律性。它還能明顯增加cGMP水平，延長房室結(jié)的ERP和減慢傳導，抑制交感神經(jīng)或異丙腎上腺素所致早后、遲后除極而發(fā)揮抗心律失常作用。本品暫未被分類于Ⅰ～Ⅳ類抗心律失常藥中。

藥代動力學^[2]

本品代謝迅速，T_1/2僅10～20s，起效快而作用短暫。故必須快速iv。但國外也有專供iv drip制劑。

臨床應用和適應癥^[2]

本品特點是抑制房室結(jié)的傳導，可立即終止由房室結(jié)折返引起的陣發(fā)性室上性心動過速，幾乎100%有效，對W-P-W型預激綜合征也有同樣效果。對房撲、房內(nèi)折返所致的心律失常無效。

主要參考資料

[1] CN201610211194.9 一種生物樣品中腺苷含量的檢測方法

[2] 最新藥物手冊