5746-86-1/降煙堿的危害有哪些

背景及概述^[1]

煙草是雙子葉植物綱（Dicotyledoneac）管花目（Tubiflorae）茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotiana），多為一年生草本，是我國重要的經(jīng)濟作物。煙草主莖的高度從十幾厘米到幾百厘米。單葉互生，有葉柄或無葉柄，葉形變化較大。聚傘狀花序，花色有黃色、白色、紫色、紅色等。管狀或鐘狀花萼，管圓筒形花冠。5 枚雄蕊著生于花冠基部，子房三室或四室。每個蒴果約有 2000粒種子。莖、葉和花萼都有腺毛，能分泌粘液。最重要的是大多數(shù)煙草屬植物能產(chǎn)生一種特有的生物堿，含量在 0.5 %-10 %，煙草中生物堿的組成和含量是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。煙堿的生物合成，煙堿和降煙堿之間轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制，一直是煙草研究熱點。研究將利用基因工程技術(shù)，進(jìn)一步闡述降煙堿代謝調(diào)控的分子機制，為煙草的“降焦減害”提供理論基礎(chǔ)。

危害^[1]

煙堿（nicotine）是普通煙草（Nicotiana tabacum L.）中主要的生物堿，占生物堿總含量的 90 ％-95 ％，降煙堿含量通常低于生物堿的 5％。但一些白肋煙和烤煙品種在成熟和加工過程中會將煙堿轉(zhuǎn)化為降煙堿，使降煙堿成為含量最高的生物堿。高溫條件下降煙堿生成麥斯明（myosmine）和取代吡啶化合物，影響煙草的本來香味。此外對人體健康有危害，是潛在致癌物質(zhì)亞硝基降煙堿（nitrosonornicotine，NNN）的合成前體，降煙堿本身也能直接誘導(dǎo)吸煙者血漿中蛋白的異常糖基化，與類固醇類藥物發(fā)生共價反應(yīng)，影響藥效和毒性。

含量測定^[2]

降煙堿是卷煙煙絲中的主要生物堿之一，對卷煙品質(zhì)有重要影響，并是煙草特有亞硝胺——亞硝基降煙堿（NNN）的前體物質(zhì)。降煙堿分子含有一個手性中心，所以降煙堿有兩個對映體：S-(-)-降煙堿（簡稱S-降煙堿）和R-(+)-降煙堿（簡稱R-降煙堿）。根據(jù)對映異 構(gòu)體的特性，降煙堿的兩個對映對映體可能具有完全不同的代謝機理和生理特性。因此，有必要對卷煙煙絲中降煙堿的對映異構(gòu)體含量進(jìn)行分析測定。目前，文獻(xiàn)報道降煙堿對映異構(gòu)體的測定方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、多維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等，但是，GC-MS和MDGC-MS需要 在前處理過程中進(jìn)行衍生化，費時費力，CE僅使用保留時間進(jìn)行定性，定性能力相對較差，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此有必要開發(fā)一種靈敏度高、精密度好、適合大批量準(zhǔn)確定量卷煙煙絲中S-降煙堿和R-降煙堿的方法?；谏鲜黾夹g(shù)不足，有研究建立了一種合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定卷 煙煙絲中降煙堿對映異構(gòu)體含量的方法。本方法在前處理過程中不需要衍生化過程，實現(xiàn)了S-降煙堿和R-降煙堿的基線分離，并使用二級質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量，避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果，所以，本方法具有操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確定好等優(yōu)點。通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：將卷煙煙絲樣品干燥、粉碎和過篩，樣品經(jīng)過氫氧化鈉溶液浸潤后，采用二氯甲烷萃取，萃取液經(jīng)基質(zhì)分散固相萃取凈化后，使用串聯(lián)手性柱-合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析，采用峰面積歸一化法定量檢測卷煙煙絲中S-降煙堿和R-降煙堿的比例。具體步驟如下：

1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稱取約100.0 mg的S-(-)-降煙堿標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中， 配制成濃度約為2.0 mg/mL的S-(-)-降煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液；稱取約100.0 mg的R-(+)-降煙堿 標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶液稀釋定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度約為2.0 mg/mL的R-(+)- 降煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液；利用S-(-)-降煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液和R-(+)-降煙堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋配制S- (-)-降煙堿和R-(+)-降煙堿濃度分別為100 μg/mL和100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液

2）卷煙煙絲樣品的混勻：將卷煙煙絲樣品置于40 ℃烘箱中，1小時后將卷煙煙絲取出，粉碎后過0.45毫米孔徑標(biāo)準(zhǔn)篩。

3）卷煙煙絲樣品的萃?。哼x擇正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷五種溶劑進(jìn)行萃取效率的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷對降煙堿的萃取效率最高，甲基叔丁基醚和乙酸乙酯次之，正己烷和三氯甲烷的萃取效率最差，故選擇二氯甲烷為最終的萃取溶劑。優(yōu)化的萃取步驟為：稱取0.3 g已粉碎的樣品于15 mL具塞離心管中，加入2.0 mL 5%的氫氧化鈉溶液（質(zhì)量比），渦旋1 min混勻后靜置10 min浸潤樣品，取10 mL二氯甲烷到離心管中，并于旋渦混合 器上以4000 rpm速度振蕩30 min。

4）萃取液的凈化：取1.5 mL上清液于2 mL凈化離心管中（內(nèi)含150 mg無水硫酸鎂，50mg PSA吸附劑，25 mg GCB吸附劑，統(tǒng)稱基質(zhì)分散固相萃取材料），于旋渦混合器上以4000 rpm振蕩2 min，以 10000 rpm離心1 min。取上清液過0.45 μm有機相濾膜后進(jìn)液相分析。

5）串聯(lián)手性柱-合相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法條件：分析柱1為Trefoil CEL1柱（柱長 150 mm，內(nèi)徑3.0 mm，固定相粒徑2.5 µm），分析柱 2為Chiralcel OD-H液相色譜柱(柱長 250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，固定相粒徑5 µm)；流動相A 為：CO2，流動相B：含0.05%異丙胺的甲醇；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫條件為：0.0 min， 97% A；0.5 min，97% A；8.0 min，92% A；12.0 min，92% A； 30.0 min，90% A。柱溫40 ℃；進(jìn)樣室溫度：10 ℃；進(jìn)樣體積2 μL；背壓：1600 psi；ISM補償流路流動相為含0.1%甲酸的甲醇，流速為0.3 mL/min。分析時間總計30 min。質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧源，掃描方式為正離子掃描，離子源溫度為300 ℃，電噴霧電壓為5000 V，霧化氣壓力為40 psi；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；。通過對峰面積進(jìn)行歸一化定量S-降煙堿和R-降煙堿占總降煙堿的比例。

6）檢出限和定量限：在優(yōu)化條件下，按照目標(biāo)物信噪比為3時對應(yīng)的濃度作為檢出限，按照目標(biāo)物信噪比為 10時對應(yīng)的濃度作為檢出限。S-降煙堿的檢出限和定量限分別為0.12 μg/g和0.40 μg/g， R-降煙堿的檢出限和定量限分別為0.12 μg/g和0.40 μg/g。

7）精密度：取同一卷煙煙絲樣品進(jìn)行5次日內(nèi)和日間平行測定，考察了上述方法的精密度，結(jié)果表明，卷煙煙絲樣品中S-降煙堿的日內(nèi)和日間測定結(jié)果的變異系數(shù)分別為1.08%和2.45%，精密度較好。

主要參考資料

[1] 煙草（Nicotiana tabacum L.）降煙堿代謝調(diào)控的分子機制研究

[2] CN201710698782.4一種合相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法測定卷煙煙絲中降煙堿對映異構(gòu)體含量的方法