56-87-1/L-賴氨酸的制備方法

背景及概述^[1]

L?賴氨酸是人體第一必須氨基酸，是合成核蛋白、血紅蛋白及合成脂肪酸代謝的重要載體?肉毒堿的重要成份，還是促進大腦神經(jīng)細胞再生的重要氨基酸，賴氨酸可增加胃蛋白酶及胃酸分泌，因此能促進老人及兒童的食欲。賴氨酸對營養(yǎng)不良、乙型肝炎、支氣管炎等有一定的輔助療效。賴氨酸與鐵化合物一起，治療貧血效果顯著。

制備^[1-3]

報道一、

(1)向L?賴氨酸鹽酸鹽中加入純化水(去離子水)，L?賴氨酸鹽酸鹽與純化水的重量比為1∶1，混合均勻并完全溶解，放置待用；

(2)上柱吸附

將步驟(1)所得的溶解液按13L/分鐘的流速，加入裝有陽離子交換樹脂的離子交換柱內(nèi)，至樹脂陽離子交換樹脂全部吸附賴氨酸、且柱子的排出液內(nèi)不含有賴氨酸，然后用純化水通過交換柱內(nèi)的樹脂進行洗滌，洗至柱子的流出液中無Cl?(此時流出液的pH為7)；

(3)洗脫

然后用2mol/L的NH4OH(氨水)把L?賴氨酸洗脫下來，NH4OH以13L/分鐘的流速流經(jīng)離子交換柱，當(dāng)離子交換柱的流出液pH值上升至8.0時，流出液開始有茚三酮反應(yīng)即L?賴氨酸開始流出，收集流出液；當(dāng)離子交換柱的流出液pH值上升至9.0～12時茚三酮反應(yīng)顏色深，此時L?賴氨酸含量高，洗脫至流出液無茚三酮反應(yīng)即可停止收集；

(4)減壓濃縮

將收集液在0.2Mpa、60～62℃減壓濃縮趕氨，濃縮至原收集液體積的1/3時、加入此時濃縮液重量3.5％的活性炭進行脫色、過濾，冷卻結(jié)晶，即得L?賴氨酸。

采用電位滴定儀檢測并計算的產(chǎn)物純度為98.5％。

報道二、

游離L-賴氨酸固體的制備：稱取1.00kgL-賴氨酸鹽酸鹽加入到5.0L純化水中攪拌溶解澄清，然后將溶液加入到7.20kg活化后的強酸性陽離子交換樹脂柱上，緩慢沖洗樹脂柱，2-3h沖洗完，再繼續(xù)用純化水沖洗至中性和無氯離子(0.1mol/L硝酸銀監(jiān)測和廣泛pH試紙)為止。用11.1kg5％v/v的氨水加入到樹脂柱上，緩慢沖洗樹脂柱2-3h左右，沖洗過程檢測pH值大于10時，開始收集堿性洗脫液，直到pH值減小到10左右停止收集。將收集到的溶液在60℃(-0.10～-0.08Mpa)減壓濃縮，濃縮出水和氨氣，直到無液滴滴出，繼續(xù)濃縮變成白色固體，向體系中加入8L的無水乙醇，繼續(xù)打漿析晶，打漿3h，析出所有固體，離心過濾出固體，直到無液滴滴出，將濾餅平鋪到搪瓷托盤，真空干燥(60±5℃，-0.08～-0.1Mpa)8h，將產(chǎn)品冷卻室溫，裝入密封袋密封陰涼處保存，得到游離L-賴氨酸固體776g，收率96.95％，純度：99.62％，HNMR(D2O):3.223-3.188(CHN)、2.848-2.794(2H/CH2N)、1.542-1.523、1.276(-CH2CH2CH2-)。LCMS(M+1):147.1127。

報道三、

L-賴氨酸的發(fā)酵方法包括賴氨酸一級種子培養(yǎng)、賴氨酸二級種子培養(yǎng)和賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)三個步驟。每個步驟的具體操作如下：

1、賴氨酸一級種子培養(yǎng)

配制賴氨酸一級種子培養(yǎng)基。本實施例中賴氨酸一級種子培養(yǎng)基包括蔗糖20g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，硫酸銨9g/L，酵母浸粉5g/L，蘇氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.5g/L，味精7g/L，丙酮酸鈉0.5g/L，醋酸鈣1g/L。

將配制好的賴氨酸一級種子培養(yǎng)基，用20％(體積比)氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值為6.0，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至36℃并維持恒定。開攪拌300rpm，按照通風(fēng)比1：0.4通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，并用氨水調(diào)節(jié)pH至6.7并維持恒定，校溶氧100％。

將產(chǎn)賴氨酸大腸桿菌搖瓶種子按賴氨酸一級種子培養(yǎng)基體積的1‰接到賴氨酸一級種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測總糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且總糖下降至10g/L時停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟一級種子液。

2、賴氨酸二級種子培養(yǎng)

配制賴氨酸二級種子培養(yǎng)基。本實施例中賴氨酸二級種子培養(yǎng)基包括葡萄糖70g/L，硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，硫酸銨10g/L，玉米漿水解液1g/L，毛發(fā)水解液1g/L，甜菜糖蜜10ml/L，蘇氨酸0.4g/L，蛋氨酸0.4g/L，醋酸鈣2g/L。

將配制好的賴氨酸二級種子培養(yǎng)基，用氨水調(diào)節(jié)其pH值為6.2，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至37℃并維持恒定。開攪拌300rpm，按照通風(fēng)比1：0.4通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.05Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH值為6.6并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(1)得到的成熟賴氨酸一級種子液按賴氨酸二級種子培養(yǎng)基體積的2％接到賴氨酸二級種子培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧30-50％，培養(yǎng)10h后，每隔2h取樣鏡檢并測還原糖，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且還原糖下降至8g/L時停止培養(yǎng)，得到賴氨酸成熟二級種子液。

3、賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)

配制賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基。本實施例中賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖20g/L，硫酸鎂0.5g/L，磷酸0.3/L，硫酸銨9g/L，玉米漿水解液0.5g/L，毛發(fā)水解液0.5g/L，甜菜糖蜜10ml/L，甜菜堿0.5g/L，醋酸鈣1g/L。

將配制好的賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基，用20％氫氧化鉀調(diào)節(jié)其pH指為5.6，通水蒸氣將培養(yǎng)基升溫至121℃，滅菌20min，開循環(huán)水降溫至36℃并維持恒定。開攪拌400rpm，按照通風(fēng)比1：0.3通入無菌空氣，調(diào)節(jié)罐壓為0.07Mpa，用氨水調(diào)節(jié)pH值為6.7并維持恒定，校溶氧100％。將步驟(2)得到的成熟賴氨酸二級種子液按賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10％接到賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速、風(fēng)量、罐壓控制溶氧25-40％。

培養(yǎng)過程中每2h取樣測發(fā)酵液的還原糖濃度和氨氮濃度，當(dāng)發(fā)酵液中的還原糖濃度下降至4g/L時，開始流加60％(m/v)葡萄糖溶液并維持發(fā)酵液的還原糖濃度為4g/L左右，當(dāng)發(fā)酵液中的氨氮濃度下降至1g/L時，開始流加40％(m/v)硫酸銨溶液并維持發(fā)酵液中的氨氮濃度為1g/L左右。

參考文獻

[1][中國發(fā)明]CN201110456105.4L-賴氨酸的制備方法

[2][中國發(fā)明]CN202010925450.7一種游離L-賴氨酸固體的制備方法

[3][中國發(fā)明]CN201611239506.3一種L-賴氨酸的發(fā)酵方法