52705-93-8/人參皂苷Rd的制備與生物活性

背景及概述^[1]

人參皂苷(Ginsenoside)是一種固醇類化合物，三萜皂苷，主要存在于人參屬藥材中。人參皂苷被視為是人參中的活性成分，因而成為研究的目標(biāo)，目前已分離鑒定出40余種人參皂苷單體。因?yàn)槿藚⒃碥沼绊懥硕嘀氐拇x通路，所以其效能也是復(fù)雜的，并且各種人參皂苷的效能是難以分離出來的。而對單體進(jìn)行生物活性研究易于闡明其確切的藥理作用，故對于人參皂苷單體化合物的研究越來越多。人參皂苷單體化合物中Rg1、Rb1、Rc等量較高，而Rd、Rg3、Rh2等屬于稀有皂苷，但藥理活性卻優(yōu)于主要人參皂苷。其中，人參皂苷Rd是主要皂苷代謝后在腸道中吸收利用的主要形式之一，對神經(jīng)系統(tǒng)、心腦血管以及腎功能都具有良好的藥理作用。

制備^[1]

一種人參皂苷Rd的提取工藝，如圖1所示，包括以下步驟：

1、將含有人參皂苷Rd成分的藥材(比如三七、人參、西洋參等)粉碎成50目的藥粉，加2倍量85％乙醇，冷浸16h，濾過，藥渣加1.8倍量85％乙醇，回流提取3次，每次2小時，濾過，合并濾液，回收乙醇并濃縮至相對密度為1.24的浸膏，得總提取物。

2、提取總皂苷

(1)裝柱：用乙醇充分濕潤預(yù)先處理過的D101大孔吸附樹脂，攪拌排除氣泡，裝柱，浸泡12h，用95％乙醇沖洗至流出液加水混合后不呈渾濁為止，繼用純化水置換其中的乙醇至無醇味，備用；

(2)上樣：取總提取物，加2倍量純化水，攪勻，緩緩加入預(yù)先處理過的D101大孔吸附樹脂柱中，使全部進(jìn)入柱床，靜置吸附12h；

(3)洗脫：先用5L/kg硅膠純化水洗脫，水洗脫液棄去；繼用不少于純化水用量的60％乙醇洗脫，收集60％乙醇洗脫液，回收乙醇并減壓濃縮至相對密度為1.20的清膏，得總皂苷，大孔樹脂柱用5BV 95％乙醇洗脫后備用。

3、提取人參皂苷Rd粗品

(1)上柱樣品制備：取總皂苷，吸附于2倍量的硅膠上，揮發(fā)至干，過60目篩，備用；

(2)裝柱：取總皂苷10倍量的柱層析硅膠，用正丁醇-乙酸乙酯-水＝2﹕3﹕5的上層溶液濕法裝柱，反復(fù)用洗脫劑洗脫，使硅膠充分下沉緊密；

(3)上樣及洗脫：硅膠層析柱中預(yù)留一定量的洗脫液使其淹沒硅膠(即保證硅膠柱內(nèi)液面高于硅膠頂部，以避免因柱內(nèi)干燥而出現(xiàn)硅膠斷層而影響分離效果)，將上柱樣品慢慢加入層析柱中，用正丁醇-乙酸乙酯-水＝2﹕3﹕5的上層溶液等度洗脫，分段收集，每流份收集量為1.5L/kg硅膠，經(jīng)薄層色譜檢查后合并人參皂苷Rd流份，68℃減壓回收溶劑至干，得人參皂苷Rd粗品。

4、純化人參皂苷Rd

(1)上柱樣品制備：取人參皂苷Rd粗品，按2.5mL甲醇/g人參皂苷Rd粗品的比例用甲醇溶解后，加入甲醇體積1/3的純化水，攪勻，備用；

(2)裝柱：按1kg硅膠/30g人參皂苷Rd粗品的比例稱取反相層析硅膠Rp-C18，用甲醇濕法裝柱；

(3)上樣及洗脫：將上柱樣品濕法上柱，用甲醇-水＝75﹕25等度洗脫，分段收集，每流份收集量為0.5L/kg硅膠，經(jīng)薄層色譜檢查后合并所需組分，78℃減壓回收溶劑至上柱樣品體積的1.8倍，靜置16h，析出沉淀，上層液返回反相層析硅膠柱分離，沉淀于40℃真空干燥，得人參皂苷Rd，反相層析柱用6L甲醇洗脫后備用。

生物活性研究^[2-4]

張佳舒等人通過人參皂苷Rd處理HEK293T細(xì)胞后,組蛋白H3K9ac、H3K18ac表達(dá)水平降低,但催化修飾這2個位點(diǎn)的P300沒有明顯變化;同時人參皂苷Rd可上調(diào)HDAC2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平,si HDAC2處理HEK293T細(xì)胞后,逆轉(zhuǎn)了人參皂苷Rd對H3K9ac、H3K18ac的下調(diào)作用。結(jié)論人參皂苷Rd通過上調(diào)HDAC2,下調(diào)組蛋白H3K9和H3K18位賴氨酸位點(diǎn)的乙?；?從而影響下游基因的轉(zhuǎn)錄激活。

黃海云報(bào)道了人參皂苷Rd對乳腺增生有較好的治療作用,其治療作用機(jī)制可能與改善乳腺增生大鼠的微循環(huán)、調(diào)節(jié)雌激素和孕激素及對應(yīng)受體的表達(dá)有關(guān)。

高進(jìn)賢等人報(bào)道了人參皂苷Rd對冰醋酸所致的扭體及福爾馬林所致的舔足反應(yīng)均有抑制作用（P<0.05）;給予CaCl₂和Ver后, 人參皂苷Rd的鎮(zhèn)痛作用被CaCl₂拮抗,被Ver加強(qiáng)（P<0.01）; 人參皂苷Rd可明顯減少小鼠脊髓背角、大腦皮層和丘腦PKCγ免疫陽性細(xì)胞（P<0.01）。結(jié)論: 人參皂苷Rd的鎮(zhèn)痛作用涉及外周和中樞,Ca²⁺與PKCγ參與了人參皂苷Rd的鎮(zhèn)痛作用。

主要參考資料

[1] CN201510001503.5一種人參皂苷Rd的提取工藝

[2] 張佳舒,孟雪,趙書涵,邱智東,劉達(dá).人參皂苷Rd對組蛋白H3乙?；恼{(diào)控機(jī)制研究[J].中草藥,2018,49(12):2931-2936.

[3] 黃海云,高進(jìn)賢,孫全武,郝榮亮,時榮,朱菊花,劉波.人參皂苷Rd對大鼠乳腺增生的治療作用[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2017,43(06):47-52.

[4] 高進(jìn)賢,張秀娟,石磊,孫全武,黃海云.人參皂苷Rd鎮(zhèn)痛作用與中樞PKCγ相關(guān)機(jī)制研究[J].西部中醫(yī)藥,2017,30(09):30-34.