52232-67-4 / 醋酸特立帕肽的應(yīng)用、制備、作用機(jī)制

背景及概述^[1][2]

特立帕肽是一種合成的34肽，為人甲狀旁腺素PTH的1-34氨基酸片段，該片段是含有84個(gè)氨基酸的內(nèi)源性甲狀旁腺素PTH具有生物活性的N-末端區(qū)域。本品的免疫學(xué)和生物學(xué)特性與內(nèi)源性甲狀旁腺素PTH以及牛甲狀旁腺素PTH(bPTH)完全相同。

醋酸特立帕肽是第一種獲得美國(guó)食品及藥物管理局FDA批準(zhǔn)的骨形成劑類新藥，這種甲狀旁腺激素的衍生物可以通過增加成骨細(xì)胞的活性及數(shù)量而促進(jìn)骨生長(zhǎng)，而目前的常規(guī)骨質(zhì)疏松藥物一般只是作用于破骨細(xì)胞而減緩或阻斷骨質(zhì)流失，醋酸特立帕肽是由禮來藥廠生產(chǎn)的，涉及到1637例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的臨床研究結(jié)果顯示，與那些只服用了鈣和維生素D補(bǔ)加劑的患者相比，96％的患者在接受該藥治療后，其脊柱和臀部的骨(礦物質(zhì))密度BMD均表現(xiàn)出顯著增加，此外還發(fā)現(xiàn)，該藥能夠分別減少發(fā)生脊柱骨折和其他類型骨折危險(xiǎn)的65％和53％。對(duì)于本品制備的方法，已有專利技術(shù)進(jìn)行公開。中國(guó)專利公開了以2-氯三苯甲基氯樹脂(2-CTC樹脂)為固相載體風(fēng)味5個(gè)片段進(jìn)行偶聯(lián)，雖然該方法可以縮短合成周期，但是其總收率最高僅為32.2％。

制備^[2]

醋酸特立帕肽制備如下：

步驟1：肽樹脂1的合成

將200g取代值為0.65mmol/g的HMPLinkerAmide樹脂，加入到固相反應(yīng)柱中，加入DMF溶脹樹脂30分鐘后抽干。取100.6gFmoc-Phe-OH和35.1gHOBt，用DMF溶解，加入到上述樹脂中，攪拌均勻后再加入35mLDIC和3.2gDMAP，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6小時(shí)，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌3次后，DCM洗滌3次，甲醇洗滌3次，每次洗滌時(shí)間為3min，得到Fmoc-Phe-HMPLinkerAmide樹脂，取代值為0.50mmol/g。

步驟2：特立帕肽肽樹脂的合成

取0.1mol步驟1的Fmoc-Phe-HMPLinkerAmide樹脂(取代值為0.50mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保護(hù)25分鐘，洗滌過濾，得到去Fmoc的H-Phe-HMPLinkerAmide樹脂。取0.3molFmoc-Asn(Trt)和0.3molHOBt，用適量DMF溶解；另取0.3molDIC，攪拌下慢慢加入，繼續(xù)攪拌反應(yīng)30分鐘，加入到上述H-Phe-HMPLinkerAmide樹脂中，偶聯(lián)反應(yīng)120～300分鐘，反應(yīng)終點(diǎn)以茚三酮法檢測(cè)為準(zhǔn)，洗滌過濾，再用20％PIP/DMF溶液去保護(hù)25分鐘，洗滌過濾，得H-Asn(Trt)-Phe-HMPLinkerAmide樹脂。同上法依次接入下表保護(hù)氨基酸或片段，得到特立帕肽肽樹脂：

H-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Ile-Gln(Trt)-Leu-Met-His(Trt)-Asn(Trt)-Leu-Gly-Lys(Boc)-His(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Val-His(Trt)-Asn(Trt)-Phe-HMPLinkerAmide樹脂

步驟3：特立帕肽粗品的制備

取0.05mol步驟2制得的特立帕肽肽樹脂，加入體積百分比為90％的TFA、體積百分比為5％的EDT、余量為水組成的混合酸解液酸解(混合酸解液10mL/克特立帕肽樹脂)，攪拌均勻，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，反應(yīng)混合物使用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量TFA洗滌3次，合并濾液后減壓濃縮，加入無水乙醚沉淀，再用無水乙醚洗沉淀3次，抽干得類白色粉末即為特立帕肽粗品，粗品純度為85.7％。

步驟4：特立帕肽粗品純化

取步驟3所得特立帕肽粗品，加水?dāng)嚢枞芙猓芤河?.45μm微孔濾膜過濾，純化備用；采用高效液相色譜法進(jìn)行純化，純化用色譜填料為10μm的反相C18，流動(dòng)相系統(tǒng)為0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度系統(tǒng)洗脫，循環(huán)進(jìn)樣純化，取粗品溶液上樣于色譜柱中，啟動(dòng)流動(dòng)相洗脫，收集主峰蒸去乙腈后，得特立帕肽純化中間體濃縮液；取特立帕肽純化中間體濃縮液，用0.45μm濾膜濾過備用；采用高效液相色譜法進(jìn)行換鹽，流動(dòng)相系統(tǒng)為1％醋酸/水溶液-乙腈，純化用色譜填料為10μm的反相C18，77mm*250mm的色譜柱流速為90mL/min，采用梯度洗脫，循環(huán)上樣方法，上樣于色譜柱中，啟動(dòng)流動(dòng)相洗脫，采集圖譜，觀測(cè)吸收度的變化，收集換鹽主峰并用分析液相檢測(cè)純度，合并換鹽主峰溶液，減壓濃縮，得到醋酸特立帕肽水溶液，冷凍干燥，得特立帕肽純品98.8g，總收率為47.3％，分子量：4178.8(100％M+H)，純度：99.4％，最大單一雜質(zhì)0.11％。

作用機(jī)制^[3]

甲狀旁腺激素(parathyroidhormone，PTH)是調(diào)節(jié)血液中鈣磷代謝的主要激素，由甲狀旁腺主細(xì)胞分泌，是一種由84個(gè)氨基酸組成的多肽，其結(jié)構(gòu)不含半胱氨酸，可與PTH受體結(jié)合，對(duì)骨代謝發(fā)揮雙向作用。PTH受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族，受體分為Ⅰ型和Ⅱ型。PTH-Ⅰ受體主要分布于骨骼及腎，PTH-Ⅱ受體分布于腦和胰腺。N端肽鏈與PTH-Ⅰ受體結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)骨細(xì)胞生長(zhǎng)的作用；而C端肽鏈與PTH-Ⅱ受體結(jié)合，可發(fā)揮促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡的作用。特立帕肽是PTH的活性片段(PTH1-34，C181H291N55O51S2)，分子量為4117.8U，是目前唯一可以促進(jìn)骨合成代謝的藥物。該藥物由美國(guó)禮來公司通過生物合成技術(shù)，以大腸埃希菌為宿主研發(fā)的一種甲狀旁腺激素的衍生物。其34個(gè)氨基酸序列與人體PTH的N端氨基酸序列一致，保持了PTH完整的生物活性。與天然PTH相比，保存了與PTH-Ⅰ受體結(jié)合調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的作用，同時(shí)也消除了PTH的C端所帶來的促進(jìn)骨凋亡作用。2002年12月美國(guó)FDA批準(zhǔn)其上市，用于絕經(jīng)后女性和男性骨質(zhì)疏松的治療，推薦劑量為20μg/d。皮下注射本品20μg，達(dá)峰時(shí)間30min，半衰期為60min，3h內(nèi)即可降至不可測(cè)水平。靜脈注射血清半衰期為5min，生物利用度為95%，90%藥物經(jīng)腎清除。特立帕肽可通過抑制成骨細(xì)胞凋亡、激活骨襯細(xì)胞和增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化來介導(dǎo)骨代謝。通過調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A傳導(dǎo)通路間歇性刺激成骨細(xì)胞、骨襯細(xì)胞和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞表面PHT-Ⅰ受體，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、延長(zhǎng)成骨細(xì)胞壽命；通過磷酸酯C-胞漿鈣離子-蛋白激酶C信號(hào)傳導(dǎo)通路，刺激成骨細(xì)胞系增殖；通過抑制PPARγ的反式激活活性，減少基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞系分化，使成骨細(xì)胞數(shù)量增加；通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子間接調(diào)節(jié)骨的成長(zhǎng)，例如可以誘導(dǎo)iGF-1與成骨細(xì)胞結(jié)合，從而促進(jìn)骨的形成；通過Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨形成的過程，從而增加骨的形成。

應(yīng)用^[3]

特立帕肽可以促進(jìn)骨形成、提高骨密度、降低骨折風(fēng)險(xiǎn)，其在骨質(zhì)疏松性骨折的治療中有著獨(dú)特的作用和優(yōu)勢(shì)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)，特立帕肽可以加速骨與外側(cè)骨皮質(zhì)的形成，促進(jìn)大鼠股骨骨折愈合。對(duì)去卵巢大鼠(3個(gè)月)行脛骨雙側(cè)干骺端截骨術(shù)，建立骨質(zhì)疏松性骨折模型，并間歇性小劑量給予特立帕肽，發(fā)現(xiàn)特立帕肽可以促進(jìn)骨折愈合且無任何全身性不良反應(yīng)；該作者采用去卵巢大鼠(8個(gè)月)及假手術(shù)雄性大鼠進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)特立帕肽可以增加大鼠肌肉的毛細(xì)血管密度，促進(jìn)骨折愈合，并且無全身不良反應(yīng)。

對(duì)80只小鼠進(jìn)行截骨術(shù)和脛骨髓內(nèi)釘固定以探究特立帕肽促進(jìn)骨折愈合的作用與骨折部位機(jī)械負(fù)荷之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)特立帕肽在負(fù)重的條件下促進(jìn)骨折愈合的效果更好；研究發(fā)現(xiàn)，即使在機(jī)械負(fù)荷降低的情況下，特立帕肽也可以促進(jìn)骨折愈合。通過定量計(jì)算機(jī)斷層掃描(QCT)和計(jì)算機(jī)斷層掃描成像技術(shù)(HR-PQCT)分析發(fā)現(xiàn)，特立帕肽與唑來膦酸對(duì)去勢(shì)大鼠骨折愈合具有累加效應(yīng)，可顯著增加去勢(shì)大鼠骨小梁密度和皮質(zhì)厚度，促進(jìn)骨痂形成。臨床試驗(yàn)方面，通過系統(tǒng)回顧發(fā)現(xiàn)，對(duì)于伴有骨質(zhì)疏松性骨折患者特立帕肽不但能夠治療骨質(zhì)疏松也可能促進(jìn)骨折的愈合。為探究特立帕肽對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折的愈合作用，以橈骨遠(yuǎn)端骨折的絕經(jīng)期后女性為研究對(duì)象進(jìn)行了前瞻性隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)。試驗(yàn)共納入102名患者，隨機(jī)分為3組，分別給予安慰劑、40μg特立帕肽、20μg特立帕肽，治療時(shí)間共計(jì)8周，隨訪期限為44周。研究發(fā)現(xiàn)，特立帕肽組愈合速度明顯快于安慰劑組，且20μg組愈合最快，40μg組無劑量?jī)?yōu)勢(shì)。

以恥骨或恥骨聯(lián)合骨折的絕經(jīng)期后女性為研究對(duì)象，進(jìn)行了隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)，共納入65名患者，隨機(jī)分為2組，一組應(yīng)用rhPTH1-84，另一組用安慰劑作為對(duì)照。試驗(yàn)組骨折愈合時(shí)間明顯短于對(duì)照組，試驗(yàn)第8周進(jìn)行視覺模擬疼痛評(píng)分發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組疼痛程度明顯低于對(duì)照組；第12周時(shí)，試驗(yàn)組功能較對(duì)照明顯改善。除此之外，有多項(xiàng)病例報(bào)道提示特立帕肽可能逆轉(zhuǎn)骨折延遲愈合甚至不愈合，包括絕經(jīng)后女性股骨遠(yuǎn)端干骺端骨折不愈合、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后假體周圍骨折不愈合、跖骨應(yīng)力性骨折、胸骨骨折不愈合、萎縮性肱骨不連、髖關(guān)節(jié)骨折、低磷酸酯酶癥導(dǎo)致的股骨近端假性骨折和跖骨應(yīng)力性骨折以及骨質(zhì)疏松癥患者長(zhǎng)期應(yīng)用雙磷酸鹽類藥物導(dǎo)致的股骨非典型骨折。這些患者使用特立帕肽的療程為2個(gè)月~2年。其中2例在骨折發(fā)生2周內(nèi)即開始使用甲狀旁腺激素進(jìn)行治療，其他患者在骨折延遲愈合或不愈合后，采用特立帕肽進(jìn)行治療，治療后1~3個(gè)月，可見骨不連處骨痂形成；治療后5~21個(gè)月，骨折部位完全愈合。大量的研究顯示，特立帕肽在各適應(yīng)證人群中具有良好的療效和安全性。特立帕肽的不良反應(yīng)多表現(xiàn)為疼痛、嘔吐、眩暈、高血鈣及高尿鈣。雖有動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)大劑量特立帕肽可增加大鼠骨肉瘤的發(fā)生率，但在臨床研究中未得到證實(shí)。

主要參考資料

[1] CN201810119038.9一種特立帕肽醋酸鹽的純化及離子控制方法

[2] CN201510295556.2一種合成特立帕肽的方法

[3] 特立帕肽治療骨質(zhì)疏松性骨折的研究進(jìn)展