51805-45-9 / 二硫鍵還原劑TCEP.HCL的性質(zhì)和應(yīng)用

TCEP鹽酸鹽，即三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽（結(jié)構(gòu)見圖1），是三價(jià)磷系衍生物中作用最優(yōu)的。它是一種無色、無味、易溶于水的弱還原性物質(zhì)，在水中溶解度能達(dá)到310mg/mL。其在空氣和水溶液中具有較高的穩(wěn)定性，受溫度和濃度的影響小。TCEP是一種極為合適的二硫鍵還原試劑（還原原理見圖1），對(duì)還原二硫鍵選擇性極強(qiáng)，除半胱氨酸外，幾乎沒有與其它氨基酸的副反應(yīng)，并且能在更寬的pH值范圍包括酸性條件(pH值3)下使用，從而有效減少酰胺鍵的水解。TCEP的反應(yīng)活性溫和、易溶、毒性小，且更容易操作，在酸性、堿性溶液中的穩(wěn)定性都很好。而且其還原能力比DTT強(qiáng)，比DTT更穩(wěn)定，它的作用可以維持2~3周，是公認(rèn)的DTT(二硫代蘇糖醇)的一種良好替代物。

圖1.TCEP鹽酸鹽化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2.TCEP鹽酸鹽還原二硫鍵原理

性質(zhì)

2.1溶解度

TCEP鹽酸鹽分子量286.65，在水中溶解度為310g/L，對(duì)應(yīng)的摩爾濃度為1.08mol/L。由于是鹽酸鹽結(jié)構(gòu)，其在各個(gè)PH值的水溶液條件下都有很好的溶解度，配制各種濃度的水溶液非常方便。TCEP鹽酸鹽在常規(guī)的有機(jī)溶劑如甲醇、乙醇中溶解度都非常小。

2.2溶液穩(wěn)定性

TCEP鹽酸鹽在酸性、堿性水溶液中都相對(duì)穩(wěn)定。TCEP鹽酸鹽直接溶于水后，水溶液的PH值大概為2.5。研究表明：將TCEP鹽酸配置成100mMol/L的鹽酸、氫氧化鈉或其他類型的緩沖溶液時(shí)，溶液室溫保存24h后（緩沖液清單見下表1），有效成分幾乎沒有減少。幾周后檢測(cè)，僅僅有約20%的TCEP鹽酸鹽被氧化失效。

2.3有效還原PH值范圍

相對(duì)于DTT，TCEP鹽酸鹽可以在較寬的PH范圍內(nèi)還原二硫鍵[1]。實(shí)驗(yàn)表明，其在PH=1.5-9.0范圍內(nèi)，只需要30秒就可以將二硫二吡啶徹底還原。如果PH>9.0，只有50%的二硫二吡啶被還原。相對(duì)于DTT，在溶液PH<8.0時(shí)，TCEP鹽酸鹽的還原性更強(qiáng)，其甚至可以還原氧化態(tài)的DTT。

2.4有效還原濃度

一般情況下，使用相對(duì)過量的TCEP鹽酸鹽，5-50mMol/L的濃度幾分鐘就可以在室溫條件下將多肽或蛋白中的二硫鍵徹底還原。Han試驗(yàn)表明，使用30uMol/L濃度的TCEP鹽酸鹽，在PH=1.5-8.5范圍內(nèi)，大約40分鐘內(nèi)可以將二硫二吡啶徹底還原。如果僅使用等當(dāng)量的TCEP鹽酸鹽，徹底還原需要的時(shí)間會(huì)更長。Mery報(bào)道使用1:1當(dāng)量的TCEP鹽酸鹽徹底還原二硫鍵的大概時(shí)間為1小時(shí)。

2.5使用范圍

（1）因?yàn)門CEP鹽酸中不包含硫的結(jié)構(gòu)，其還原反應(yīng)液不需要進(jìn)行額外的提純，可以直接用于含有馬來酰亞胺或交聯(lián)試劑的溶液。一般情況下，TCEP鹽酸鹽濃度小于10-20mMol/L可以直接用于含有馬來酰亞胺的化學(xué)反應(yīng)。

（2）50mMol/L的TCEP鹽酸鹽溶液可以作為DTT或者2-巰基乙醇替代試劑，但是TCEP鹽酸需要在溶液中才能發(fā)揮作用，所以它不適合用于等電聚焦電泳（IEF）。

（3）當(dāng)涉及到在免疫球蛋白鉸鏈區(qū)還原二硫鍵進(jìn)行的抗體標(biāo)記，需同時(shí)還原重鏈和輕鏈的操作時(shí)。這類特殊還原操作一般使用2-巰基乙胺。Blauenstein證實(shí)了TCEP鹽酸鹽也可以用于以上特殊的還原操作。將3.8-4.0mMol/L的TCEP鹽酸鹽溶液加入到10mg/ml的免疫球蛋白于0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，緩沖溶液PH大約4.6-7.5，室溫20-30分鐘就可以將二硫鍵還原，通過脫鹽柱可以去除TCEP鹽酸鹽還原副產(chǎn)物。

參考文獻(xiàn)

[1].Levison, M.E., et al. (1969). Reduction of biological substances bywater-soluble phosphines: Gamma-globulin. Experentia25:126-7.

[2].Han, J.C., et al. (1994). A procedure for quantitative determination oftris(2-carboxyethyl)phosphine, an odorless reducing agent more stable andeffective than dithiothreitol. AnalBiochem220:5-10.

[3].Mery, J., et al. (1993). Disulfide linkage to polyacrylic resin for automatedFmoc peptide synthesis. Immunochemical applications of peptide resins andmercaptoamide peptides. Int J PeptideProtein Res42:44-52.

[4].Blauenstein, P., et al. (1995). Experience with theiodine-123 and technetium-99m labeled anti-granulocyte antibody Mab47: acomparison of labeling methods. Eur JNuclear Med22:690-8.