517-28-2/病理技術(shù)探討—— 蘇木素—伊紅染色

蘇木素是從洋蘇木中提取的一種染色劑，它在被氧化后生成蘇木精，易溶于酒精和甘油，較難溶于水，需加熱才能溶解。這是一種永久染色劑。其他常用的含有蘇木素的染色劑有磷鎢酸蘇木素染色劑，也就是磷鎢酸與蘇木素的混合物，蘇木素染色劑經(jīng)常為組織的研究使用。

染色及染色的方法在我國公元前就發(fā)展的相當(dāng)普遍，勞動人民首先發(fā)明了織物的染色方法，所用的染料是從動物、植物、礦物質(zhì)中提煉出來的。由于受到紡織物品染色技術(shù)的影響，推動了生物學(xué)、組織學(xué)和形態(tài)學(xué)化學(xué)染色方法和技術(shù)的發(fā)展。任何組織的切片，如果不進(jìn)行染色，看不到組織的細(xì)微結(jié)構(gòu)，看不到細(xì)胞核，更無法分辨出腫瘤的良惡性，不能向臨床醫(yī)師提供診斷依據(jù)，更不能為病人的正確治療提供方案。所以染色在病理組織形態(tài)學(xué)的診斷、科學(xué)實驗研究以及教學(xué)工作中具有重要的意義和實用價值。
科學(xué)的進(jìn)步和質(zhì)量控制的需要，現(xiàn)市場有多家提供商品化的各種成品染色試劑，已被各大醫(yī)院病理科和實驗室所接受。但是，我們的病理技術(shù)人員也要必須掌握各種試劑的配制和染色原理，否則，難以制出合格的病理切片。

蘇木素染色原理及配制方法

一、蘇木素來源及染色原理

蘇木素是一種天然染料，是從蘇木素樹（Haematoxylin Compechianum）的樹心木提煉出來的。它原產(chǎn)于墨西哥的坎佩切（Campeche），因此而得名。它多生長在西印度群島，雖然使用年限較早，但是著色性能一直很差。直到70年代蘇木素有了新的提取方法，是將蘇木樹鋸倒后剝?nèi)ネ馄?，將樹心木先用熱水浸泡，再加尿素沉淀（Lamb，1974）后制成的染料才比較穩(wěn)定。自從有蘇木素以來，蘇木素在單獨使用時著色能力很差，但仍然是最常用的染細(xì)胞核的組織學(xué)染料。為了獲得最佳的蘇木素染色液必須具備以下兩個條件：一是必須能產(chǎn)生有效成分蘇木因（Haematein）；二是染色時需要加適量的媒染劑（如硫酸鋁鉀、氯化鐵及硫酸鐵胺等）。
蘇木因是由蘇木素氧化而產(chǎn)生的，是按傳統(tǒng)的方法暴露于陽光和空氣之下，叫做熟化，需要3—4個月的時間。如用氧化劑使之快速成熟也可得到較好的結(jié)果，但是使用壽命不如自然氧化的蘇木素。
蘇木素所以被稱為染料是因為蘇木素的分子氧化后成為生物染料——氧化蘇木紅。在常規(guī)蘇木素伊紅染色中，蘇木素經(jīng)過氧化變成酸性染料蘇木紅，蘇木紅與二價或三價的金屬鹽或氫氧化物結(jié)合形成帶正電荷的藍(lán)色色精，只有在這種情況下才能與細(xì)胞中帶負(fù)電荷的脫氧核糖核酸結(jié)合完成染色。蘇木紅和媒染劑的結(jié)合不但較好地顯示細(xì)胞核成分，還可與組織中的其他物質(zhì)進(jìn)行結(jié)合。
蘇木素呈淡黃色，用人工氧化的方法可以快速全部地將蘇木素變成蘇木紅。但如果過氧化就會破壞染料的分子結(jié)構(gòu)影響染色力。

二、蘇木素染色液的配制

1.Harris蘇木素液
蘇木素2.5g，
無水乙醇25ml，
硫酸鋁鉀50g，
蒸餾水500ml，
氧化汞1.25g，
冰乙酸20 ml。

[配制方法]
A液：將蘇木素溶于無水乙醇中，加熱至完全溶解。B液：將硫酸鋁鉀溶于蒸餾水加熱溶解；A液倒入B液中加熱使溶液盡快沸騰，去火緩慢加入氧化汞，防止溶液溢出。然后再煮沸1—2分鐘，立即浸入冷水冷卻后備用。臨用時加入冰乙酸過濾即可。

[注意事項]
(1)加熱的A液倒入加熱的B液中，防止液體噴出，應(yīng)緩慢分多次倒入，禁止在明火上操作。
(2)加氧化汞時要少量地緩慢加入。防止多量快速地加入氧化汞，避免液體溢出，也可將氧化汞溶解于10ml水中慢慢加入。
(3)氧化汞加入后煮沸時間不要過長，防止過度氧化。
(4)氧化汞如潮解有顆粒要用藥勺背壓碎成粉末狀加入。
(5)如需自然氧化的蘇木素不加氧化汞，三個月以后用時加入20ml冰乙酸過濾后即可應(yīng)用。
(6)用于配液燒瓶要大于配制試劑量的一倍以上為宜。

2.Harris改良蘇木素液配制方法
蘇木素 2.5g
無水乙醇 25 ml
硫酸鋁鉀 17g
蒸餾水 500 ml
氧化汞 0.5g
冰乙酸 5ml

[配制方法]
用燒瓶將蘇木素溶于無水乙醇中，水溫加熱至完全溶解。再用大的燒瓶取500ml蒸餾水加熱至85℃時放入硫酸鋁鉀，待完全溶解后再加熱至91℃，然后慢慢倒入溶解的蘇木素乙醇液，讓溶液溫度保持在89℃—91℃之間再慢慢加入氧化汞，充分?jǐn)嚢杈鶆虺掷m(xù)1—2分鐘后迅速入水冷卻。臨用時加冰乙酸即可。

[注意事項]
(1)溶解硫酸鋁鉀不要溫度過高和長時間煮沸（硫酸鋁鉀是堿式鹽，溫度過高或時間過長會造成堿式鹽分解，金屬鋁析生成為氫氧化鋁易產(chǎn)生混濁）。
(2)將氧化汞溶解于10ml水中慢慢加入較為安全。
(3)整個配制過程用水浴加溫容易控制溫度。

3.無汞蘇木素液配制方法
蘇木素 10g
無水乙醇200ml
硫酸鋁鉀60g
蒸餾水2200ml
1%高碘酸80ml
將蘇木素溶于無水乙醇，稍加熱溶解。硫酸鋁鉀溶于蒸餾水中，加熱至完全溶解。再將蘇木素乙醇液倒入。加入1%高碘酸，迅速冷卻后過濾即可應(yīng)用。

伊紅的染色原理及配制方法

一、伊紅的染色原理
伊紅是一種酸性胞漿性染料，而胞漿的染色與PH值有著密切的關(guān)系，它們均是帶負(fù)電荷的。在染液中加入適量冰乙酸使細(xì)胞漿帶正電荷（陽離子），就可以被帶負(fù)電荷（陰離子）的染料染色。伊紅是一種化學(xué)合成的酸性染料，在水中分解成帶負(fù)電荷的陰離子與蛋白質(zhì)的氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而成使細(xì)胞胞漿、紅細(xì)胞、肌肉組織、嗜伊紅顆粒、結(jié)締組織等被染成不同程度紅色或粉紅色，與藍(lán)色的細(xì)胞核形成鮮明的對比，所以伊紅是染細(xì)胞漿的最佳染料。

二、伊紅染液的配制
1.水溶性伊紅液
伊紅Y(水溶性)1ɡ
蒸餾水100ml
伊紅Y溶于少許蒸餾水中，用玻璃棒攪拌溶解后，加蒸餾水至100ml。

2.醇溶性伊紅液
伊紅Y（純?nèi)苄裕?ɡ
95% 乙醇
伊紅Y（純?nèi)苄裕┤苡谏倭?5% 乙醇中，用玻璃棒攪拌徹底溶解后，95%乙醇補(bǔ)足100ml。

3.水溶性伊紅乙醇液
伊紅Y(水溶性)1ɡ
蒸餾水75ml
95%乙醇25ml
伊紅Y溶于少許蒸餾水中，用玻璃棒攪拌溶解后加入剩余蒸餾水，再加95%乙醇。

4.沉淀酸化伊紅Y乙醇液
伊紅Y20g
蒸餾水500ml
伊紅Y用蒸餾水充分溶解加濃鹽酸10ml，攪拌均勻，放置過夜，析出沉淀。用濾紙過濾，濾液不要，沉淀物與濾紙一起放恒溫箱干燥，用95%乙醇1000ml配成沉淀酸化伊紅Y乙醇儲存液。
臨用時，取飽和液1份，加95%乙醇2份，配成工作液。

5．SIGMA伊紅水溶液
伊紅1g
蒸餾水100ml
伊紅放入蒸餾水中迅速震蕩溶解后不用過濾，可以立即使用。

蘇木素伊紅染色的分化控制與返藍(lán)

一、分化的目的與控制
蘇木素染色水洗后必須進(jìn)行分化處理。分化就是用某些試劑（1%的鹽酸酒精液），因酸能破壞蘇木素的醌型結(jié)構(gòu)，促使色素與組織解離，將細(xì)胞核中結(jié)合過多的染料和細(xì)胞漿中吸附的染料及不需要著色的部位去除掉，以利于伊紅的染色，這個過程稱為分化。
分化不管是使用手工控制或用機(jī)染控制要根據(jù)分化液的新鮮程度來決定分化時間。如果是新鮮配制的分化液分化時間要短一些，反之分化時間就要長一些；蘇木素染色時間久分化的時間要長一些，反之分化時間就要短一些。分化一定要使細(xì)胞核、核仁及染色質(zhì)清晰可見，必須在顯微鏡下控制分化，分化不可過度，分化適宜后迅速放入自來水沖洗去除酸后而中止分化。

二、返藍(lán)的目的與控制
蘇木素染色后經(jīng)1℅鹽酸酒精液分化;切片是在酸性環(huán)境中,這時顏色是紅褐色。切片進(jìn)入弱堿性自來水沖洗或用返藍(lán)液（0.5%氫氧化氨水溶液）在堿性環(huán)境中就會由紅褐色變成藍(lán)色。這是因為染料蘇木紅加鋁，形成的藍(lán)色色精在酸性環(huán)境中處于離子狀態(tài)，此時為紅色。在堿性環(huán)境中處于結(jié)合狀態(tài)，呈藍(lán)色。

三、分化液、返藍(lán)液的配制
1.分化液
濃鹽酸1ml
70%乙醇99ml
2.返藍(lán)液
氫氧化氨0.5ml
蒸餾水99.5ml

蘇木素伊紅染色手工操作程序及注意事項

自從有組織學(xué)切片制作及染色的技術(shù)以來，蘇木素-伊紅的染色方法程序多少年來一直采用手工操作的方法來完成。
蘇木素伊紅染色手工操作方法可以對不同的組織進(jìn)行不同程度的染色時間，特別是對細(xì)胞核多的淋巴結(jié)組織及腺體等組織染色后分化時間要比正常組織長些，直到顯微鏡下控制滿意為止。
蘇木素伊紅染色手工操作完全靠經(jīng)驗，靠工作的責(zé)任心，才能達(dá)到滿意的染色結(jié)果。

一、染色程序
1．切片入二甲苯I脫蠟 5分鐘
2．二甲苯II脫蠟 5分鐘
3．二甲苯III脫蠟 5分鐘
4．無水乙醇I 1分鐘
5．無水乙醇II 30秒
6．95％ 乙醇 30秒
7．85％乙醇 30秒
8． 75％乙醇 30秒
9．自來水沖洗
10．蘇木素染液 5－10分鐘
11．自來水沖洗
12．1％鹽酸酒精分化數(shù)秒（鏡下控制）
13．自來水沖洗
14．0.5％氨水返蘭數(shù)秒
15．自來水沖洗1分鐘，鏡下控制細(xì)胞核分化程度
16．1％伊紅水溶液1－3分鐘
17．適度自來水洗
18．85％乙醇脫水10秒
19．95％乙醇脫水10秒
20．95％乙醇脫水10秒
21．無水乙醇I脫水30秒
22．無水乙醇II脫水30秒
23．無水乙醇III脫水1分鐘
24．二甲苯I透明1分鐘
25．二甲苯II透明1分鐘
26．二甲苯III透明1分鐘
27．中性樹膠封固

二、染色注意事項
1．脫蠟要徹底，時間寧長勿短。脫蠟徹底的切片呈透明狀，如有白色呈云霧狀為脫蠟不干凈。脫蠟徹底與否取決于環(huán)境溫度、切片溫度、二甲苯脫蠟使用的時間及脫蠟片數(shù)來決定。
2．二甲苯的容器要密閉，嚴(yán)禁液體外溢，避免或減少二甲苯對人體的毒害，必須在通風(fēng)柜櫥中進(jìn)行操作。
3．蘇木素-伊紅的染色時間應(yīng)根據(jù)組織不同、組織新舊、固定液不同、固定時間、環(huán)境溫度、染色液新舊、切片厚薄及染片數(shù)量來決定。淋巴結(jié)等細(xì)胞核密集的組織應(yīng)縮短染色時間，而腦、肌肉、心肌等胞漿占比例較大的組織則要延長染色時間。新鮮組織易著色，陳舊組織較難著色，甚至不著色。
4．染色后不宜在水中停留時間過長，防止染色質(zhì)變藍(lán)后不易分化；伊紅染色后水洗時間要短，否則易脫色。整個過程要在顯微鏡下觀察控制染色效果。
5．H、E的染色成敗關(guān)鍵在于鹽酸酒精分化及返蘭，一定要在鏡下控制，
嚴(yán)格掌握時間。進(jìn)行分化時，肉眼觀察組織切片由原來的深藍(lán)色變?yōu)榧t
色至粉紅色時即恰到好處，再沖水返藍(lán)。
6．切片脫水時在低濃度酒精時間不宜過長，對伊紅有分色及退色作用。在無水乙醇脫水時間應(yīng)稍長，保證最后一步酒精要純，防止將水份帶入二甲苯。二甲苯后兩步宜慢，以利于無水乙醇徹底脫凈，封片后如切片呈云霧狀，說明最后一步二甲苯不純。

（本文作者：北京協(xié)和醫(yī)院王德田教授， 摘自《實用現(xiàn)代病理學(xué)技術(shù)》精裝，中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社。本文已授權(quán)，如要轉(zhuǎn)載請注明轉(zhuǎn)自“優(yōu)納科技微信平臺”）