51481-10-8/脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測

背景及概述^[1][2]

嘔吐毒素的主體成分為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，主要是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)產(chǎn)生的真菌毒素。1972年，日本的Morooka等人首次從赤霉病大麥中將其分離，Yoshizawa等L2 稍后闡明了它的結(jié)構(gòu)，并將其命名為嘔吐毒素(4deoxynivalenol，DON)。DON在全球范圍內(nèi)廣泛存在，尤其是溫暖潮濕地區(qū)的糧食及其制品中，如美國、加拿大以及我國華南等地，歐洲北部和中部的谷物DON檢出率分別高達(dá)70％和66％L5 J，國內(nèi)形勢也不容樂觀。

近年來，隨著氣候條件的惡化，DON逐步向北蔓延，在浙江、江蘇、山東、河南等地的檢出率不斷升高。由于其穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)、較強的熱抵抗力、耐壓、耐酸性，在加工過程中很難被除去，一直成為糧食生產(chǎn)加工過程中的隱患。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2762-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量中規(guī)定DON限量為≤1000 g/kg，聯(lián)合國糧農(nóng)組織規(guī)定食用糧食中DON的含量<1000 kg。中國傳統(tǒng)飲食習(xí)慣中糧比例大大高于西方，使得嘔吐毒素的危害更為突出。

結(jié)構(gòu)

性質(zhì)^[1]

DON 的化學(xué)名為32，72，l5一三羥基草鐮孢菌-9-烯-8-酮，CAS：51481-10-8，分子式C₁₅H₂₀O₆，相對分子量296.32。屬單端孢霉烯族化合物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定?？膳c核糖體60s亞基的肽轉(zhuǎn)移酶活性中心結(jié)合引發(fā)核糖體應(yīng)激反應(yīng)，抑制DNA、RNA和蛋白的合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用，對腸道、免疫系統(tǒng)造成破壞，并且具有遺傳毒性，對人和動物的身體健康具有嚴(yán)重影響，是人畜食品中檢出率和超標(biāo)率最高的一種真菌毒素。DON具有很強的細(xì)胞毒性和免疫抑制性，對人和動物的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，歐盟分類標(biāo)準(zhǔn)為三級致癌物。

危害^[3]

DON是已知的單端孢霉烯族化合物中毒性最強的一種對人類和動物均可造成危害，嚴(yán)重影響人和牲畜的健康。人類攝入了被DON污染的面粉及其制成的食品后，可能會引起嘔吐、腹瀉、頭疼、頭暈等以消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)為主的中毒癥狀，嚴(yán)重時會損害造血系統(tǒng)造成死亡。對于抵抗力較低的老人和兒童，其癥狀表現(xiàn)較為嚴(yán)重。有的病人還有乏力、全身不適，步伐不穩(wěn)等似酒醉樣癥狀，其慢性毒性表現(xiàn)為對胃癌細(xì)胞有一定的影響。

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查表明：動物食用DON后，一般表現(xiàn)可引起實驗動物食欲下降、體重降低、代謝紊亂等慢性中毒表現(xiàn)，并具有免疫毒性和生殖發(fā)育毒性。并導(dǎo)致血磷和堿性磷酸酯酶活性下降。聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織早在1973年聯(lián)合召開的第三次食品添加劑和污染物會議上，就將單端孢霉烯族毒素定為最危險的自然發(fā)生食品污染物。

檢測^[1]

1.薄層色譜法

薄層色譜法是最早建立的一種檢測方法。GB/T 5009.111-2003ll 谷物及其制品中嘔吐毒素的測定就采用了薄層色譜法，其檢測限為1 mg/kg。適用于谷物如小麥、玉米、大麥等及其制品如蛋糕、餅干、面包等中嘔吐毒素的測定。最低檢出限為20 ixg/kg-300 g/kg。操作簡便，但是也有一些缺點，如靈敏度差，處理樣品時工作量大，且提取過程中需要使用大量的有機溶劑，適用于具有一定實驗室條件的檢測，對于基層糧食企業(yè)還存在局限性。

2.試紙條/卡法

DON快速檢測膠體金法應(yīng)用膠體金比色技術(shù)免疫競爭反應(yīng)原理，能夠快速檢測糧食及其加工制品中DON。主要有分為定性條法和定量條法。

1）定性條法糧食企業(yè)單位根據(jù)需要選擇如500、800、1000等限量的試紙條，通過結(jié)果的陰陽性判定樣品中DON是否在某一定量限內(nèi)。該方法價格低廉，操作簡單快捷，對檢驗人員的實驗技能要求不高，不需要配備額外的儀器設(shè)備，在糧食收購及入庫過程中的把關(guān)及檢驗機構(gòu)的前期大批量篩選中非常實用，是基層糧食企業(yè)的優(yōu)質(zhì)選擇。

2）定量條法定量條法同樣基于競爭性免疫反應(yīng)原理進(jìn)行檢測，根據(jù)試紙條上檢測T線與質(zhì)控C線的顏色深淺與樣品中待檢測物的含量之間的對應(yīng)關(guān)系，通過手持式試紙條掃描讀書儀讀出最終結(jié)果，該方法檢出限為250 g/kg，整個檢測過程不到10 min。

3. 試劑盒法

試劑盒法基于間接酶聯(lián)免疫原理，在酶標(biāo)板微孔上預(yù)包被DON抗原，樣本中的嘔吐毒素和微孔上預(yù)包被的抗原競爭DON抗體(抗試劑)，同時嘔吐毒素抗體與酶標(biāo)二抗(酶標(biāo)物)相結(jié)合，經(jīng)TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含嘔吐毒素含量呈負(fù)相關(guān)，由此可知樣本中DON含量。檢出限為200 g/kg，適用于大量樣品的準(zhǔn)確、快速分析。

4.真菌毒素及重金屬快速檢測及監(jiān)測分析系統(tǒng)

真菌毒素及重金屬快速檢測及監(jiān)測分析系統(tǒng)也基于膠體金比色技術(shù)免疫競爭反應(yīng)原理，除具備定量條法的所有優(yōu)點外，完善了快檢技術(shù)平臺，可實現(xiàn)檢測數(shù)據(jù)實時交互及在線檢測，還可同時檢測真菌毒素及重金屬鉛和鎘。試紙條無苛刻的儲存條件，實驗簡單快速，對檢驗人員的技術(shù)要求低，試劑環(huán)保安全，實驗殘余無污染。隨著對糧食安全的逐漸重視，快速檢測系統(tǒng)在糧食企業(yè)，尤其是基層糧食企業(yè)的應(yīng)用前景將十分廣闊。

5. 儀器法

1）氣相色譜法氣相色譜法檢測DON具有靈敏、高選擇性、準(zhǔn)確性和精確性等優(yōu)點，還可同時檢測單端孢霉烯族化合物及玉米赤霉烯酮等真菌毒素，但是變異系數(shù)大。早在1986年，AOAC就利用氣相色譜法檢測小麥中的DON含量，但氣相色譜法尚存在一系列問題，有待標(biāo)準(zhǔn)化。

氣相色譜法檢測DON需要進(jìn)行衍生化處理，實驗繁瑣負(fù)責(zé)，儀器設(shè)備昂貴，多在研究性機構(gòu)或單位，在基層糧食企業(yè)的應(yīng)用還存在一定的局限，技術(shù)上存在的問題也在一定程度上限制了其在糧食行業(yè)的推廣應(yīng)用。

2）高效液相色譜法GB23503-200918中用提取液提取試樣中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，經(jīng)免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜紫外檢測器測定，外標(biāo)法定量。該方法檢測靈敏度高，操作步驟簡單，不需要進(jìn)行衍生化反應(yīng)，逐漸代替了氣相色譜法，但高效液相色譜儀器設(shè)備成本高，用時長，操作繁瑣，需要專門人員操作，一次檢測只能測定DON含量，不能同時檢測DON衍生物。串聯(lián)質(zhì)譜后可同解決這一問題。

6. 其他方法

有學(xué)者不斷嘗試將近紅外光譜及傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜、熒光極性免疫等方法應(yīng)用于DON 的快速檢測分析。使用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜研究了DON含量在50 到16000~g/kg之間的樣品，建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的多路傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜檢測方法。這些方法大大簡化了實驗步驟，縮短了分析時間，但還有待近一步探索完善并最標(biāo)準(zhǔn)化，離在糧食行業(yè)中的推廣應(yīng)用還有一段距離。

主要參考資料

[1] 盛林霞, 付豪, 吳藝影, 等. 糧食中嘔吐毒素檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 糧食儲藏, 2018, 47(1): 32-36.

[2] 鮑淑青, 張克英, 陳海軍. 飼料中嘔吐毒素的危害與防治[J]. 中國飼料, 2007 (17): 34-36.

[3] 孫秀蘭, 邵景東, 王俊雙. 糧油食品中嘔吐毒素危害及風(fēng)險分析[J]. 糧食與油脂, 2007 (3): 41-43.