50-28-2/雌二醇的制劑方法和制備方法

背景及概述^[1-2]

雌二醇[17β-雌二醇或雌-1，3，5(10)-三烯-3，17-二醇，(17-β)]或E2是分子量為272.38道爾頓的C18甾體激素。它是性激素，稱為“雌性”激素(也存在于雄性中)，其是一組內(nèi)源甾體中最有效的雌激素，其包括雌酮(E1)和雌三醇(E3)。在女性中，主要由卵巢產(chǎn)生雌二醇，由腎上腺次級(jí)產(chǎn)生，并在脂肪組織中將甾體前體轉(zhuǎn)化至雌激素。雌二醇負(fù)責(zé)乳腺和生殖上皮的生長(zhǎng)以及第二性征的發(fā)育。除了促進(jìn)健康的骨結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)女性膽固醇水平外，雌二醇的正常水平提供適當(dāng)?shù)呐怕?、受孕和妊娠。在男性中，睪丸和腎上腺是雌二醇的主要來(lái)源。雌二醇被需要用于維持激素平衡和其他腺體的功能。

目前，用于補(bǔ)充雌激素的最主要藥物有兩類，一類為來(lái)源于馬尿的雌酮；另一類為化學(xué)合成的雌二醇。馬尿雌酮是最早應(yīng)用的雌激素替代物，被全世界廣泛應(yīng)用達(dá)數(shù)十年之久，幾乎成為雌激素的代名詞，其制備和純化的方法已相當(dāng)成熟。但研究顯示，人體真正需要的雌激素為雌二醇，而孕馬尿中的雌激素成分主要是雌酮、馬烯雌酮、馬奈雌酮等；所述雌酮為雌二醇的代謝產(chǎn)物，活性不足雌二醇的十分之一，且有提高心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)、肝損傷、乳腺癌等毒副作用；因此由于雌酮具有高度的副作用，而通常被俗認(rèn)為是壞雌激素。

制備^[1][5]

報(bào)道一、

還原雌酮成為雌二醇：

懸浮2g(7.4mmol)雌酮在10ml水中，加入0.11g(0.37mmol)二甲基二辛 基氯化銨、0.4g(7.4mmol)KBH4，在油浴55℃中機(jī)械攪拌3小時(shí)。將反應(yīng)物過(guò) 濾，粗品用甲醇重結(jié)晶得到β-雌二醇1.84g，收率91％。m.p.178-179℃，氫核 磁共振譜(400MHz，CDCl3)δ：7.95(m，1H，-OH)，7.06(d，J＝8Hz，1H，1-H) 6.53-6.61(m，2H，2-H，4-H)，3.67(m，1H，17-H)，0.73(s，3H，18-H)。

報(bào)道二、

采用人骨髓來(lái)源細(xì)胞使用化合物三甲基膽蒽（MCA）誘導(dǎo)產(chǎn)生并篩選出細(xì)胞，并使用該細(xì)胞在體外合成性雌二醇；所述細(xì)胞已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)CCTCC C2012173；

制備步驟為：

（1）人骨髓來(lái)源細(xì)胞（HMBDCs，主要成分為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）采用現(xiàn)有技術(shù)（本實(shí)施例采用骨髓沖洗、貼壁法）進(jìn)行原代培養(yǎng)制備，制備的細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，直至105個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)瓶；

（2）培養(yǎng)基中加入MCA，使其終濃度為1ug/ml，并每星期更換含MCA的培養(yǎng)基2次；MCA處理1周后結(jié)束；細(xì)胞在37℃，5%CO2環(huán)境中，持續(xù)常規(guī)培養(yǎng)；

（3）培養(yǎng)至3個(gè)月，培養(yǎng)物中可見(jiàn)細(xì)胞中出現(xiàn)生殖細(xì)胞樣細(xì)胞；上述生殖細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞的標(biāo)志物：Oct4、Nanos3、c-Kit、DAZL、Vasa；

（4）培養(yǎng)液中檢測(cè)到雌二醇的持續(xù)表達(dá)，與未經(jīng)誘導(dǎo)處理hBMDCs（E2=65±14.8pmol/L， n=6）相比，MCA誘導(dǎo)后hBMDCs中（E2=3243±947 pmol/L， n=6）雌二醇的濃度高達(dá)50倍（p<0.01）差異有顯著性；重新傳代后，觀察到隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，雌二醇濃度進(jìn)行性增加，傳代培養(yǎng)至10天左右達(dá)到高峰，高達(dá)4500pmol/L，隨后逐步下降，最終維持到較高水平；

（5）體內(nèi)雌二醇是由卵巢中卵泡合成，在體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)后hBMDCs中，觀察到卵泡樣結(jié)構(gòu)的形成（為誘導(dǎo)后hBMDCs中產(chǎn)生雌激素提供細(xì)胞支持）；卵母細(xì)胞的發(fā)育需雌二醇的促進(jìn)，若缺乏雌二醇，卵母細(xì)胞的最大只能長(zhǎng)到25微米；而誘導(dǎo)后hBMDCs中的卵母細(xì)胞樣細(xì)胞體積達(dá)到40-50微米；免疫熒光證實(shí)上述大細(xì)胞為卵母細(xì)胞；

（6）卵泡相關(guān)基因，包括雌二醇合成的關(guān)鍵性基因：STAR、p450arom、p450c17，以及卵泡發(fā)育相關(guān)基因GDF9在培養(yǎng)物中表達(dá)（進(jìn)一步支持誘導(dǎo)后hBMDCs具有合成雌二醇的能力）；

（7）優(yōu)化培養(yǎng)條件，增加雌二醇產(chǎn)生的能力，并降低培養(yǎng)液中血清的濃度（有利于雌二醇的進(jìn)一步分離純化）；上述生殖細(xì)胞樣細(xì)胞可進(jìn)一步增大產(chǎn)生早期卵泡樣結(jié)構(gòu)和卵母細(xì)胞樣細(xì)胞；

（8）按現(xiàn)有方法分離、純化，制得雌二醇。

回收方法^[3]

取30g普羅雌烯有機(jī)廢渣，投入到500ml高壓反應(yīng)釜中，加入250g甲醇，15g40wt.％稀硫酸和0.3g 10wt.％鈀碳(鈀的含量為鈀碳總質(zhì)量的10％)，密閉高壓反應(yīng)釜，用氮?dú)庵脫Q3次后，升溫至35℃，通入氫氣，使得壓力升高至2.0MPa，保溫2小時(shí)后，取樣檢測(cè)至反應(yīng)完畢。

反應(yīng)完畢后，將鈀碳過(guò)濾，濾液用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，減壓蒸餾除去溶劑，加入200g乙酸乙酯和150g純化水，攪拌30分鐘后，靜止分層；有機(jī)相用150g純化水洗滌一次，有機(jī)相再用5g無(wú)水硫酸鈉干燥，然后加入0.9g巰基硅膠攪拌1.0小時(shí)，過(guò)濾，將乙酸乙酯減壓蒸餾至干，經(jīng)過(guò)一步精制，得到雌二醇17.9g，以普羅雌烯有機(jī)廢渣總質(zhì)量計(jì)，雌二醇的產(chǎn)率為60％。

制劑方法^[4]

一種雌二醇透皮噴霧劑，由以下重量百分比的原料組成：

雌二醇 0.1％～10％；

聚合物 0.5％～10％；

促滲劑 0～20％；

增塑劑 0～10％；

溶劑 余量。

為了達(dá)到雌二醇透皮噴霧劑持續(xù)穩(wěn)定給藥的目的，需要加入能形成薄膜 的聚合物，所述的聚合物優(yōu)選為甲基丙烯酸酯共聚物、乙烯吡咯烷酮共聚物、 纖維素衍生物中的一種或多種，具體使用時(shí)可根據(jù)這些聚合物理化性質(zhì)通過(guò) 溶劑調(diào)節(jié)其在雌二醇透皮噴霧劑中的濃度，以使雌二醇透皮噴霧劑在使用時(shí) 的成膜速度和成膜性狀良好。