491-67-8 / 黃芩的基因組測序揭示黃芩素的生物合成的進化

摘要：黃芩是一種非常重要的中藥材，主要是利用曬干的根部，在中國被稱為“黃芩”。它主要用來治療肝臟和肺上的問題，可以作為一種癌癥治療的補充藥物。我們報道了一種高質(zhì)量的黃芩參考基因組，其中408.14 Mb基因組的93%被用來組裝成9個假-染色體，N50達到了33.2Mb。與其他唇形科相近的物種芝麻和一串紅進行基因組比較，揭示了黃芩中與生物活性物質(zhì)4’-脫氧黃酮的生物合成的代謝途徑相關的基因。我們發(fā)現(xiàn)了一種特殊的肉桂酸輔酶A連接酶很可能最近的突變后獲得了新的功能。在4’-脫氧黃酮的合成途徑中，有四個基因編碼的酶在黃芩基因組中是串聯(lián)重復的。更深入的分析在黃芩屬植物中揭示了基因的重復性，片段的重復，基因的擴增和點突變偶聯(lián)基因的新功能和亞功能化涉及到了4’-脫氧黃酮的生物合成。在薄荷家族中，唇形科，我們的研究不僅為特定的黃酮生物合成途徑的進化提供了重要的見解，而且為利用微生物的代謝工程或植物的分子育種來提高活性物質(zhì)的生產(chǎn)提供了一種重要的工具。黃芩的參考基因組是非常有用的，可改進薄荷家族其他成員的基因組組裝，為藥用植物中生物活性化合物的合成途徑的解碼提供了重要的基礎。

雜志名：Molecular Plant（一區(qū)13.2）（Volume 12, Issue 7, 1 July 2019, Pages 935-950）

英文題目：The ReferenceGenome Sequence ofScutellaria baicalensisProvides Insights into theEvolution of Wogonin Biosynthesis

作者：QingZhao1…Yonghong Hu1, Xiao-Ya Chen1,2 and Cathie Martin1,7

單位：中國科學院上海辰山植物科學研究中心上海市植物功能基因組學與資源重點實驗室，上海辰山植物園，上海

黃芩作為一種重要的中藥，在中國已經(jīng)有2000多年的歷史。黃芩中的黃酮類物質(zhì)具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、保肝和保護神經(jīng)的作用。因此理解黃酮的合成途徑變得尤為重要，了解其分子合成和調(diào)控機制為我們更好的利用黃酮提供基礎。黃芩素是黃芩中含量最高的黃酮類化合物之一。

黃芩中黃酮的生物合成有兩條途徑，一條路徑是，phenylalanine ammonia lyase (SbPAL), cinnamate4-hydroxylase (SbC4H), 4-coumarate coenzyme A (CoA) ligase (SbCLL1), chalcone synthase(SbCHS-1), chalcone isomerase (SbCHI), and flavone synthase II (SbFNSII1),導致4’-脫氧黃酮的合成。在根部，出現(xiàn)了另一種黃酮合成路徑（RSF），cinnamate-CoA ligase (SbCLL-7)。（圖1）

圖1黃芩中黃酮的兩條生物合成途徑

目前，我們已經(jīng)闡明了黃芩素和去甲漢黃芩素的生物合成途徑，但最后一步去甲漢黃芩素到漢黃芩素的生物合成過程，是由8-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化，還有待說明。因此全基因組測序是一種切實可行的策略，對天然化合物的代謝途徑的識別非常有幫助。這里，我們采用了二代高通量Illumina和三代PacBio聯(lián)合測序技術，報道了黃芩的參考基因組?？偦蚪M大小為408.14 Mb,其中386.63 Mb組裝到了染色體水平，達到了9個假染色體。將已公布的丹參、芨芨草和獐牙菜的基因組進行比較分析，RSFs生物合成的進化路徑似乎是通過編碼輔酶A連接酶的基因的特異性聚集而出現(xiàn)的(圖1;SbCLL-7)以及多個串聯(lián)基因復制(圖1:SbCHS-2, SBFNSII-2, SBF8h)。通過對基因組和轉(zhuǎn)錄組序列的篩選，確定了負責漢黃芩素合成的O-甲基轉(zhuǎn)移酶(OMTs)，并通過酵母體內(nèi)實驗和黃芩毛狀根的RNAi實驗證實了這一結果。

為了便于對黃芩基因組進行注釋，獲得黃芩基因的表達譜。我們對黃芩不同品系的花、花蕾、葉、莖、根和茉莉酸(JA)處理過的根的RNA樣本進行了測序。每個組織的RNA樣本以三份形式提取，并使用HiSeq 2000平臺進行測序?？偣驳玫搅?8930個基因。圖2顯示了基因、重復、非編碼RNA密度和所有檢測到的片段重復的概述。

圖2黃芩基因組組裝的圖譜概述

比較基因組分析，我們組裝了黃芩基因組，并與其他10個基因組進行比較分析。我們識別了28133個基因家族，全部11個物種有共同6811個。我們比較了四個相近物種的基因組。全部11個基因組共有的299個單拷貝基因家族，根據(jù)其建立系統(tǒng)發(fā)育樹。（圖3）

圖3比較基因組分析

尋找RSF通路演化的線索，我們對黃芩、丹參、芨芨草和苘麻四種相近的植物進行了黃酮生物合成途徑中關鍵酶的解析篩選。用三種4CL底物:肉桂酸，4-香豆酸和咖啡酸進行試驗，發(fā)現(xiàn)肉桂酸是SbCLL-7的底物，SbCLL-7的活性位點狹窄，由疏水殘基組成，有利于疏水底物，如肉桂酰腺苷酸，底物通過與Thr343和Asp424的氫鍵配位，而導致SbCLL-7能夠使用肉桂酸作為底物的變化一定與CLL-7基因的點突變有關。（圖4）

圖4黃芩中特殊ScCLL7的分析

黃芩編碼兩種CHS亞型，即SbCHS-1和SbCHS-2。SbCHS-1基因在地上部分高度表達，特別是在花中，并編碼一種參與經(jīng)典的黃酮和花青素生物合成的酶。黃芩黃酮合成酶II(FNSII)有兩種亞型:FNSII-1在植物地上部分將水仙素轉(zhuǎn)化為芹菜素，而FNSII-2在根中特異合成chrysin。黃芩基因組中有兩個編碼FNSII-1蛋白的基因，編號為Sb06g05860 (FNSII-1.1)和Sb03g20730 (FNSII-1.2)分別在假染色體6號和3號。SbCYP82D2是一種黃酮8-羥化酶，在根中只接受白楊素生成去甲漢黃芩素，分布在假染色體5號。

圖5黃芩CHS基因的進化過程

圖6 SbFNSII和SbCYP82D基因的串聯(lián)復制

我們在酵母中表達了五種PFOMT ORFs，并用去甲漢黃芩素作為底物去喂養(yǎng)細胞。所有五種酵母菌株都可以將去甲漢黃芩素轉(zhuǎn)化為漢黃芩素。后進行RNAi干擾確定了OMT的基因功能。

圖7漢黃芩素（Wogonin）生物合成的候選PFOMT基因的篩選

討論：特定的代謝物對植物適應不同環(huán)境非常重要，這些化合物通常是特異性的、嚴格調(diào)控的、高度可進化的。特定代謝途徑的進化是由基因復制和隨后的亞/新功能驅(qū)動的。黃芩屬植物的黃芩素的RSF合成途徑具有特異性?；谖覀兊谋容^基因組分析，我們現(xiàn)在可以描述這種特定的代謝途徑可能是如何進化的。之后，對RSF途徑上的每個酶進行系統(tǒng)分析，我們沒有發(fā)現(xiàn)什么有用的基因聚類，但是發(fā)現(xiàn)了編碼關鍵標記酶SbCLL-7的基因和編碼下一步CHS-2酶的基因都位于假染色體9上。也許這是基因聚類促進多態(tài)群體中4’-脫氧黃酮生物合成的最早步驟共同進化的證據(jù)，盡管這一連鎖并不緊密(兩個位點大約有12000個基因分開)，但在目前的標準下還不能作為基因聚類的證據(jù)。

黃芩屬的參考基因組的分析比較與高質(zhì)量的兩個密切相關的物種的基因組序列，已經(jīng)允許我們提出這個黃酮的新代謝途徑是如何進化和顯示,一系列不同的進化機制導致了一個屬中出現(xiàn)了特殊的代謝途徑。與薄荷家族其他成員的高質(zhì)量基因組進行相互比較，同樣可以闡明萜類化合物的特殊生物合成途徑的進化，如二萜丹參酮、酚酸和黃酮類化合物在這個代謝多樣化的植物家族中的進化。