442-51-3/去氫駱駝蓬堿的制備方法

背景及概述^[1][2]

去氫駱駝蓬堿又名哈爾堿或哈爾明。無色晶體或白色結(jié)晶性粉末。熔點262～263℃。不溶于水，且難溶于一般有機溶劑。其鹽類具有藍色熒光。由蒺藜科駱駝蓬種子提取而得。曾用作中樞神經(jīng)興奮藥。去氫駱駝蓬堿對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)也有強烈作用，還具有抗癌、鎮(zhèn)痛、消炎及抗真菌、殺細菌、抗病毒和驅(qū)蟲等作用。

制備^[1]

取駱駝蓬種子粉碎，稱量200g，加50ml5％氨水拌勻氨化20小時后，加1000ml80％甲醇溶液浸泡12小時，濾過，再加600ml80％甲醇浸泡2次，合并提取液濾過，加400ml氯仿溶液攪拌，靜置分層后，收集氯仿層，回收氯仿，得8.2g固體物。取石油醚、乙酸乙酯、甲醇、水，按17∶29∶26∶16比例混合，取上相做固定相注入高速逆流色譜儀，轉(zhuǎn)速800r/min，下相為流動相，流速2ml/min，甲醇溶解樣品，進樣分離樣品，收集去氫駱駝蓬堿流分，回收試劑，低溫真空干燥，得去氫駱駝蓬堿6.1g，含量經(jīng)高相液相檢測99.3％。

制劑^[3]

CN201610827156.6提供一種去氫駱駝蓬堿長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的制備方法，將大豆卵磷脂∶二棕櫚酰磷脂酰膽堿∶膽固醇∶二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000按照5~12∶5~12∶5~10∶1~2，溶于體積比為1∶2乙醚和氯仿混合溶劑中形成溶液,將上述溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成薄膜后，加入含磁納米粒水溶液，水化，即成；或者上述溶液與水相體積3:1比例加入含磁納米粒水溶液，冰浴超聲乳化1~2h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膠態(tài)，加水水化，即成。本發(fā)明可達到磁靶向和配體主動靶向及長循環(huán)多重作用，從而提高去氫駱駝蓬堿在腫瘤中的治療指數(shù)，降低其毒副作用；同時獨創(chuàng)性地將去氫駱駝蓬堿用于治療腦癌的藥物中，對于現(xiàn)在無特效藥的腦癌擬起到治療作用。

聯(lián)合用藥^[4]

CN201710771286.7公開了鹽酸去氫駱駝蓬堿聯(lián)合氟康唑的抗真菌產(chǎn)品及其應用，屬于醫(yī)藥技術領域，本發(fā)明以多種方法研究氟康唑和鹽酸去氫駱駝蓬堿聯(lián)用對耐藥白色念珠菌的聯(lián)合抗真菌作用。鹽酸去氫駱駝蓬堿與氟康唑聯(lián)合應用時的有效濃度配比：氟康唑：鹽酸去氫駱駝蓬堿=1:32（μg/mL，對CA3）或1:16（μg/mL，對CA4），最低抑菌濃度分別為：8μg/mL與0.25μg/mL（對CA3）或0.5μg/mL（對CA4）。鹽酸去氫駱駝蓬堿聯(lián)合氟康唑時，可以增強氟康唑?qū)δ退幇咨钪榫目咕钚裕梢援a(chǎn)生協(xié)同抗真菌作用，并能夠逆轉(zhuǎn)耐藥白色念珠菌對氟康唑的耐藥性，為新藥的開發(fā)及老藥新用提供了研究方向。

檢測^[5]

維藥駱駝蓬子為蒺藜科植物駱駝蓬PeganumharmalaL.的種子，僅收載于衛(wèi)生部藥品標準.維吾爾藥分冊，未收載于中國藥典，具有堅固經(jīng)脈、助陽暖陰和消散寒濕之氣的作用。駱駝蓬種子中的化學成分主要為β-咔啉類和喹唑啉類生物堿類成分，如去氫駱駝蓬堿(harmine，HAR)、駱駝蓬堿(harmaline，HAL)、鴨嘴花堿(vasicine，VAS)等29種生物堿?，F(xiàn)代藥理學表明，HAL、HAR具有抗菌、消炎、止癢、抗原蟲及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和對肌肉離子通道及抑制單胺氧化酶和乙酰膽堿酯酶活性等多方面藥理。

CN201710823380.2提出了一種檢測駱駝蓬子中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法利用結(jié)合紫外檢測器的高效液相色譜法進行，其中，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為甲醇-0.1體積％～0.3體積％磷酸水溶液。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，該方法具有專屬性強、準確度高、重現(xiàn)性好、靈敏度高、耐用性好，以及明顯改善色譜峰形和拖尾現(xiàn)象等優(yōu)點。該方法可用于駱駝蓬子或其提取物的質(zhì)量控制，促進對駱駝蓬子藥用價值的開發(fā)和研究。

檢測維藥駱駝蓬子中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的方法，該方法包括薄層鑒別的定性分析和HPLC法測定駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿含量的定量分析，具體如下：

①薄層鑒別方法的步驟如下：

a)供試品溶液制備：取駱駝蓬子粉末0.2g，加甲醇5mL，超聲處理10min，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5ml使溶解，取上清液，作為供試品溶液。

b)對照藥材溶液制備：取駱駝蓬子對照藥材粉末0.2g，加甲醇5mL，超聲處理10min，濾液蒸干，殘渣加甲醇0.5ml使溶解，取上清液，作為對照藥材溶液。

c)對照品溶液制備：取駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿對照品適量，加50體積％甲醇制成每1mL分別含駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿1mg的對照品溶液。

d)照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，吸取空白溶液(甲醇)、對照品溶液6μL、對照藥材溶液、供試品溶液各1μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水(10∶0.5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，并分別在紫外燈(254nm、365nm)下檢視，然后噴碘化鉍鉀試液顯色。紫外燈254nm下的薄層鑒別譜圖、紫外燈365nm下的薄層鑒別譜圖和碘化鉍鉀顯色后的薄層鑒別譜圖分別見圖1、圖2和圖3。由圖1至圖3可以看出，供試品色譜中，254nm和365nm紫外燈下，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；顯色后，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同的紅色斑點。

②HPLC法測定駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿含量的步驟如下：

a)色譜條件：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(WatersXselectCSHC18，4.6×250×mm,5μm)；以甲醇-0.1體積％磷酸水溶液(體積比為20:80)為流動相，等度洗脫；檢測波長為246nm；柱溫為25℃；流速0.8ml/min。

b)供試品溶液制備：取駱駝蓬子粉末(過三號篩，篩孔內(nèi)徑355μm±13μm)0.05g，精密稱定，置50ml量瓶中，加25體積％甲醇40ml，超聲處理15min，放冷，加25體積％甲醇定容至刻度，搖勻，取2ml置10ml量瓶中，加25體積％甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

c)對照品溶液制備：取駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿適量，加50體積％甲醇溶解，制成每ml含駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿各10μg的混合對照品溶液。

d)分別精密吸取空白溶液、對照品溶液、供試品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，進行測定，即得。

HPLC法測定駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿含量的空白溶液(25體積％甲醇)譜圖見圖4，HPLC法測定駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿含量的對照品溶液譜圖見圖5，HPLC法測定駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿含量的供試品溶液譜圖見圖6。由圖4至圖6可以看出，空白溶液對駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的測定無干擾；駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的色譜峰達到完全分離，且具有較大的分離度，駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的理論塔板數(shù)和靈敏度也較高；駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的峰形較對稱，拖尾因子小于1.5，均能滿足定量檢測要求。

藥理研究^[6]

陳蓓等人研究了去氫駱駝蓬堿干預細粒棘球蚴感染小鼠后血清中細胞因子水平的變化,探索該藥物對抗寄生蟲感染的免疫應答機制。方法無菌條件下采集羊源細粒棘球絳蟲原頭蚴,體外培養(yǎng)發(fā)育至成微囊。取10只微囊做空白對照組,另以每鼠50個微囊的劑量腹腔注射接種BALB/c雌性小鼠80只,建立細粒棘球蚴感染小鼠模型。于感染5個月后B超檢測成模性。將成模小鼠隨機分為模型對照組、阿苯達唑(ABZ 50 mg/kg體重)劑量組、去氫駱駝蓬堿(HM)高(89.4 mg/kg體重)、中(44.7 mg/kg體重)、低(22.35 mg/kg體重)劑量組。連續(xù)灌胃給藥28 d,期間觀察各組小鼠體重變化及生存情況;于治療結(jié)束后,分離各組小鼠囊泡,稱量囊濕重,計算囊重抑制率;眶動靜脈采血,檢測血細胞,比較T淋巴細胞亞群及Th1、Th2類細胞因子變化;制作小鼠肝組織標本,HE染色觀察肝臟病理改變。結(jié)果實驗小鼠成模率為90%,模型組小鼠腹腔、肝臟等部位均出現(xiàn)多個單一性包囊,體重顯著增加(P<0.01);HM組小鼠包囊縮小,鈣化灶程度較其他治療組明顯,體重顯著降低(P<0.01),生存率增高(P<0.01)。各藥物治療組囊濕重顯著低于模型組(P<0.01),HM高劑量組囊濕重(4.38±1.03)g與ABZ組(5.84±0.79)g比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。HM低劑量組囊重抑制率63.42%,與ABZ組的63.10%比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);中、高劑量組分別為70.12%和72.33%與ABZ組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。HM處理小鼠外周血CD4~+T細胞水平較模型組顯著降低(P<0.01),CD8~+ T細胞水平升高(P<0.01),(IL-2、IFN-γ的水平升高(P<0.01),IL-4、IL-10水平顯著降低(P<0.01);血WBC及Neu、Lym、Eos百分率顯著降低(P<0.01)。HE染色檢查各藥物治療組肝臟血管周圍炎細胞浸潤顯著減輕。結(jié)論去氫駱駝蓬堿顯著抑制小鼠細粒棘球蚴的發(fā)育,可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞亞群調(diào)整Th1/Th2細胞因子的平衡,改善自身免疫性,減輕炎癥反應,從而抑制蟲體生長。

主要參考資料

[1][中國發(fā)明]CN201110026186.4一種去氫駱駝蓬堿的制備方法

[2]化學物質(zhì)辭典

[3]CN201610827156.6一種去氫駱駝蓬堿長循環(huán)磁納米脂質(zhì)體的制備方法

[4]CN201710771286.7鹽酸去氫駱駝蓬堿聯(lián)合氟康唑的抗白色念珠菌產(chǎn)品及其應用

[5]CN201710823380.2檢測駱駝蓬子中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的方法

[6]陳蓓,高惠靜,鞏月紅,文麗梅,盧帥,王建華,趙軍.去氫駱駝蓬堿對細粒棘球蚴感染小鼠外周血Th1/Th2細胞因子的影響[J].中國病原生物學雜志,2019,14(09):1038-1043+1049.