369-07-3 / 主要分子生物學(xué)試劑和培養(yǎng)基

以E.coli JM109基因組為模板，分別以pQE-nlpE-F和pQE-nlpE-R、pQE-spy-F和pQE-spy-R為引物，通過高保真PCR擴(kuò)增獲得2個(gè)基因片段，大小分別為711 bp和486 bp。PCR程序：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，16 ℃ 30 s。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR過程中所使用的DNA聚合酶SYBR® Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2×Conc.)、高保真DNA聚合酶PrimerSTAR®以及限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物有限公司，一步克隆連接酶Exnase Ⅱ購自南京諾唯贊生物科技有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒以及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司，其他材料和所用試劑為國產(chǎn)分析純。引物由蘇州泓迅生物科技有限公司合成，基因測序服務(wù)由賽音生物技術(shù)(上海)有限公司提供。LB培養(yǎng)基：酵母提取物0.5%，胰蛋白胨1.0%，NaCl 1.0%，1×105 Pa滅菌20 min。

DNA制備：將過夜活化后的E. coli JM109按照1% (V/V)的接種量轉(zhuǎn)接至30 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，向搖瓶中添加不同濃度(0.2%–0.8%，V/V)丁醇，繼續(xù)培養(yǎng)90 min后，吸取菌液2 mL，于5510×g室溫離心2 min，倒出上清培養(yǎng)基收集菌體，進(jìn)行RNA的抽提。通過一步法cDNA合成(逆轉(zhuǎn)錄)試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)合成對(duì)應(yīng)的cDNA。

熒光定量PCR：以上述cDNA為模板，以qPCR-rcsB-F/R、qPCR-cpxR-F/R、qPCR-baeR-F/R、qPCR-pspA-F/R、qPCR-rpoE-F/R為引物(表 1)，采用SYBR®Green Ⅰ嵌合熒光法(大連寶生物工程有限公司)，SYBR®Green Ⅰ與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光，通過檢測PCR反應(yīng)生成雙鏈DNA與SYBR®Green Ⅰ結(jié)合發(fā)出的熒光強(qiáng)度，從而可以達(dá)到對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量的目的，反應(yīng)體系參照試劑盒說明。

使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)pQE80L載體進(jìn)行雙酶切線性化，酶切條件為37 ℃酶切6–8 h。

將PCR擴(kuò)增帶有同源臂的nlpE和spy基因片段與通過BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩種限制性內(nèi)切酶雙酶切后的pQE80L載體通過一步克隆酶法連接體系(南京諾唯贊生物科技有限公司)連接，構(gòu)建質(zhì)粒pQE80L-nlpE和pQE80L-spy(圖 1)。一步克隆連接體系為：50–200 ng線性化pQE80L，20–200 ng插入片段，2 μL 5×CE Ⅱ Buffer，1 μL Exnase Ⅱ。連接體系置于37 ℃反應(yīng)30 min，待反應(yīng)完成后置于冰上冷卻5 min，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在含有卡那霉素的固體平板。次日通過菌落PCR初步驗(yàn)證平板陽性單菌落，將驗(yàn)證出的陽性轉(zhuǎn)化子測序驗(yàn)證。

分別以spy-K-F/R和nlpE-K-F/R為引物，以質(zhì)粒pKD13為模板擴(kuò)增帶有同源臂的FRT-Kan-FRT片段(約1450 bp)，通過電擊法將含有同源臂FRT-Kan-FRT片段轉(zhuǎn)入含有pKD46的E. coli JM109感受態(tài)中，使其整合到E. coli JM109基因組上。將驗(yàn)證成功的陽性重組子按照化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備方法制備成感受態(tài)細(xì)胞，并將質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中，30 ℃過夜靜置培養(yǎng)，再通過42 ℃高溫培養(yǎng)10 h以消除質(zhì)粒pCP20。

將過夜活化的重組菌按照1% (V/V)的接種量轉(zhuǎn)接至30 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)菌體至OD600到達(dá)0.6時(shí)，添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，于30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h，在4 ℃、8801×g離心10 min收集菌體。在超聲破碎儀上進(jìn)行超聲破碎15 min (超聲1 s，間歇3 s，500 W)，破碎液進(jìn)行SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)狀況。

將重組菌和帶有pQE80L的E. coli JM109 (對(duì)照菌)經(jīng)轉(zhuǎn)接誘導(dǎo)培養(yǎng)(0.2 mmol/L IPTG)至OD600達(dá)到為0.8時(shí)，將0.8% (V/V)正丁醇加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，30 ℃、120 r/min培養(yǎng)10 h。其間每隔2 h取樣通過分光光度計(jì)OD600讀數(shù)監(jiān)測菌體的生長狀況。

采用細(xì)胞粘著碳烴化合物法(microbial adhesion to hydrocarbons，MATH)來測定細(xì)胞表面疏水性變化。根據(jù)重組菌耐受性測定的方法，將過夜活化后的對(duì)照菌株E. coli JM109/pQE80L和重組菌株E. coli JM109/pQE80L-nlpE、E. coli JM109/pQE80L-spy經(jīng)轉(zhuǎn)接誘導(dǎo)培養(yǎng)(0.2 mmol/L IPTG) 6 h，在4 ℃、8801×g條件下離心10 min收集菌體。徹底吸取培養(yǎng)基，用0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)懸浮細(xì)胞，控制初始OD400值為0.8–0.9 (A0)。吸取4.8 mL菌液與0.8 mL溶劑充分混勻，室溫靜置15 min，分層后取水相樣品測定其OD400值(A1)。粘附率用公式(1)計(jì)算。

分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)表達(dá)用微生物培養(yǎng)基產(chǎn)品：