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利巴韋林(Ribavirin)為鳥(niǎo)苷、次黃嘌呤核苷類似物，是一種廣譜抗病毒藥物，對(duì)多種DNA和RNA病毒均有較好抑制作用。具有作用位點(diǎn)多、不易產(chǎn)生耐藥性、療效高、毒性低，副作用小等特點(diǎn)，現(xiàn)已用于多種病毒的治療。在臨床上用于治療丙型肝炎病毒、呼吸道合孢病毒和拉沙熱病毒感染。
目前利巴韋林的工業(yè)化生產(chǎn)方法主要有微生物發(fā)酵法、酶法以及化學(xué)合成法。發(fā)酵法存在著生產(chǎn)周期長(zhǎng)、容易污染雜菌、利巴韋林提取工藝復(fù)雜以及能耗高等缺點(diǎn)?；瘜W(xué)合成法，反應(yīng)條件苛刻，周期長(zhǎng)，需要進(jìn)行異構(gòu)體的分離，成本居高不下，而且容易造成環(huán)境污染，所以，在工業(yè)化生產(chǎn)中受到一定的限制。酶法克服了發(fā)酵法和化學(xué)法的不足，同時(shí)生產(chǎn)成本較低，因而是較為有效的工業(yè)化生產(chǎn)方法。
其中，可以作為酶法合成利巴韋林的起始原料有鳥(niǎo)苷、肌苷、腺苷、胞苷或尿苷等。由于目前市場(chǎng)上鳥(niǎo)苷的生產(chǎn)成本較低，而且鳥(niǎo)苷作為反應(yīng)底物時(shí)的分解產(chǎn)物為鳥(niǎo)嘌呤，它的溶解度極低(幾乎不溶于水)，使得整個(gè)反應(yīng)平衡傾向于利巴韋林的合成方向，因而可以得到更高的底物轉(zhuǎn)化率。而未反應(yīng)的底物鳥(niǎo)苷可以被離心后重新利用，反應(yīng)副產(chǎn)物鳥(niǎo)嘌呤則可以用作藥物阿昔洛韋的原料，所以鳥(niǎo)苷經(jīng)常作為反應(yīng)底物，選擇PNPase作為催化劑。
酶或細(xì)胞作為催化劑由于易失活、難以反復(fù)使用、不易保藏，限制了工業(yè)化應(yīng)用。全細(xì)胞固定化技術(shù)與游離酶和細(xì)胞催化相比具有很大優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞 固定化避免了的酶的提取過(guò)程，操作相對(duì)容易，并且具有更高的操作穩(wěn)定性。細(xì)胞固定化的方法有很多種，適用于細(xì)胞固定化的方法主要有包埋法，吸附法，交聯(lián)法等，其中包埋法是最為常用的方法。由于細(xì)胞被固定化，減少了轉(zhuǎn)化液中由游離細(xì)胞裂解產(chǎn)生的蛋白，降低了提取的困難，減少了提取成本。
在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究一種高純度利巴韋林的制備方法具有非常重 要的生產(chǎn)實(shí)踐價(jià)值。
CN201610060219.X提供一種利巴韋林的制備方法，利用酶 催化法合成利巴韋林并對(duì)利巴韋林分離提取。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：
本發(fā)明所用的利巴韋林生產(chǎn)菌，是將以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis 168(ATCC23857))基因組為模板擴(kuò)增表達(dá)的PNPase基因pupG(核苷酸序 列為序列表<400>1所示序列)，與pET-His質(zhì)粒連接轉(zhuǎn)入Escherichiacoli BL21(DE3)(CICC23796)中，獲得的大腸桿菌重組菌BL21/pET-His-pupG。
一種利巴韋林的制備方法，具體方法為：
(1)以基因工程菌BL21/pET-His-pupG為菌種，使用發(fā)酵罐培養(yǎng)，獲得 細(xì)胞；
(2)使用明膠包埋細(xì)胞，制成固定化重組表達(dá)PNPase的全細(xì)胞作為催 化劑，經(jīng)酶促反應(yīng)得到利巴韋林轉(zhuǎn)化液；
(3)利巴韋林轉(zhuǎn)化液提取
a.對(duì)利巴韋林轉(zhuǎn)化液8000r/min離心5-10min，獲得上清液，將上清 液加熱至60-80℃，使用1-2％的活性炭脫色20-40min，過(guò)濾得濾清液；
b.將濾清液減壓蒸發(fā)濃縮至1/4-1/3，在0-4℃結(jié)晶10-12h，過(guò)濾析 出的鳥(niǎo)苷，繼續(xù)濃縮至利巴韋林即將析出為止，加入純乙醇，至乙醇終濃度 90％左右，利巴韋林濃度35-45g/L，在85-95℃加熱，充分?jǐn)嚢枞芙饫晚f林，趁熱過(guò)濾，將上清在0-4℃結(jié)晶1-2d，過(guò)濾制得利巴韋林結(jié)晶；
c.將利巴韋林晶體重新溶解于90％的乙醇，利巴韋林濃度35-45g/L， 85-95℃加熱溶解過(guò)濾，0-4℃結(jié)晶10-12h，即重結(jié)晶，經(jīng)過(guò)兩次重結(jié)晶后，離心分離、干燥即可得到利巴韋林純品。
吳麗君等人研究了抗病毒藥物利巴韋林的腸道滲透性。方法：采用外翻腸囊法和Caco-2單層細(xì)胞模型，收集利巴韋林給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的腸囊液及Transwell小池基底端的接收液，用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算藥物的表觀滲透系數(shù)(Papp);并以高滲透性藥物酒石酸美托洛爾為模型藥物，用相同的方法測(cè)定其滲透性，以此為參照對(duì)利巴韋林的滲透性進(jìn)行分析。
結(jié)果：外翻腸囊實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，利巴韋林的藥物濃度對(duì)其Papp無(wú)影響，為被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，且藥物的吸收無(wú)明顯的腸段特異性，利巴韋林在腸道的Papp低于酒石酸美托洛爾。Caco-2單層細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:利巴韋林的Papp值也低于酒石酸美托洛爾。結(jié)論：采用外翻腸囊法和Caco-2單層細(xì)胞模型測(cè)得利巴韋林的腸道滲透性低于酒石酸美托洛爾。
王建山研究了復(fù)方鱉甲軟肝片、利巴韋林及聚乙二醇干擾素α-2b注射液聯(lián)合治療慢性丙型肝炎的臨床效果。方法：選取河南省鄭州市第六人民醫(yī)院2016年7月耀2017年3月治療的慢性丙型肝炎患者64例，依照治療方案分為對(duì)照組(n=32)與觀察組(n=32)。
對(duì)照組給予聚乙二醇干擾素α-2b注射液聯(lián)合利巴韋林治療，觀察組給予復(fù)方鱉甲軟肝片、利巴韋林及聚乙二醇干擾素α-2b注射液聯(lián)合治療。觀察比較兩組臨床療效與治療前后肝功能指標(biāo)[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、臟硬度值(LSM)]。結(jié)果：兩組臨床療效無(wú)明顯差異(P>0.05)；治療后觀察組ALT、LSM低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論:復(fù)方鱉甲軟肝片、利巴韋林及聚乙二醇干擾素α-2b注射液聯(lián)合治療慢性丙型肝炎，能改善肝功能，療效顯著。
[1]CN201610060219.X 一種利巴韋林的制備方法
[2]吳麗君，王穎，李志琳，鄧?yán)?，賀英菊.利巴韋林腸道滲透性的研究[J].華西藥學(xué)雜志，2019(03):1-3.
[3]王建山.復(fù)方鱉甲軟肝片聯(lián)合聚乙二醇干擾素ɑ-2b注射液及利巴韋林治療32例慢性丙型肝炎的臨床研究[J].北方藥學(xué)，2019，16(06):81-82.
[4]余靜，付青青.金蓮花顆粒聯(lián)合利巴韋林治療小兒手足口病的臨床研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2019，34(04):1050-1053.