36556-06-6/抗腫瘤四氫異喹啉生物堿生物合成途徑中新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)

對(duì)結(jié)構(gòu)獨(dú)特、活性顯著的復(fù)雜天然產(chǎn)物進(jìn)行生物合成研究需要從基因、途徑及酶催化反應(yīng)的角度理解自然界生物-化學(xué)合成、調(diào)控及拮抗的過程，屬于典型的有機(jī)化學(xué)-微生物學(xué)-生物化學(xué)-天然產(chǎn)物藥學(xué)的交叉學(xué)科，對(duì)于天然產(chǎn)物藥物研究中重點(diǎn)關(guān)注新結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)、創(chuàng)造和復(fù)雜化合物的高效制備均具有重要的推動(dòng)作用。

自1974年萘啶霉素（Naphthyridinomycin，NDM）首次分離，四氫異喹啉生物堿類（Tetrahydroisoquinline, THIQ）天然產(chǎn)物已有四十余年的研究歷史。該家族化合物共包括60多種分子，大多具有顯著的抗菌及抗腫瘤活性。代表性化合物除NDM外還包括假單胞菌產(chǎn)生的番紅菌素（Safracin）、鏈霉菌產(chǎn)生的番紅霉素A（Saframycin A, SFM-A）及加勒比海鞘分離到的Ecteinascidin 743（ET-743）。特別是ET-743作為第一例海洋天然產(chǎn)物來源的抗腫瘤新藥于2007年在歐洲獲批，隨后于2015年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市。該家族化合物在有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域一直備受青睞，其生物合成途徑和涉及的詳細(xì)酶學(xué)機(jī)制也引起化學(xué)家和生物學(xué)家的廣泛關(guān)注。

中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所生命有機(jī)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的唐功利研究團(tuán)隊(duì)多年來一直致力于該家族化合物的生物合成與合成生物學(xué)研究。最近該團(tuán)隊(duì)成功解密SFM-A生物合成過程最后的修飾步驟，該過程涉及兩個(gè)關(guān)鍵蛋白SfmE和SfmCy2，它們分別參與SFM-A生物合成中后期獨(dú)特的前藥激活（Prodrug-activation）及胞外脫氨（Extracellular deamination）修飾過程。

2008年，唐功利與劉文課題組合作首先克隆了SFM-A的生物合成基因簇，初步提出其生物合成途徑。在隨后的研究中課題組成員唐滿成博士發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了蛋白SfmD以過氧化氫為氧化劑催化3-甲基酪氨酸芳香環(huán)發(fā)生羥基化。而日本的Hideaki Oikawa課題組通過體外生化實(shí)驗(yàn)重構(gòu)SFM-A的THIQ核心骨架結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)SfmC催化兩次連續(xù)的Pictet-Spengler反應(yīng)形成分子骨架，該過程中長(zhǎng)鏈脂肪酸起到了非常關(guān)鍵的導(dǎo)向作用。在最新的研究中，通過前期工作的積累以及對(duì)SFM-A基因簇的進(jìn)一步分析，唐功利研究團(tuán)隊(duì)提出以下假設(shè)：SfmC在細(xì)胞體內(nèi)催化生成SFM-A的分子骨架化合物，然而其攜帶的脂肪酸長(zhǎng)鏈保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的DNA不受到傷害；隨后跨膜蛋白SfmE將中間產(chǎn)物中的長(zhǎng)鏈保護(hù)基解離，同時(shí)小分子被泵出胞外，實(shí)現(xiàn)前藥激活并裸露一個(gè)氨基，隨后分泌型氧化酶SfmCy2催化一步脫氨反應(yīng)，將該氨基消除并形成最終產(chǎn)物SFM-A（化合物1）。

圖1. 推測(cè)的SFM-A生物合成途徑

基于以上假設(shè)，該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，將SfmCy2在S. lividans 1326中異源表達(dá)，結(jié)果顯示SfmCy2能分泌到胞外；隨后他們對(duì)胞外分泌蛋白富集后進(jìn)行端基測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明SfmCy2與生物信息學(xué)分析的結(jié)論一致：胞外分泌蛋白缺失N-端信號(hào)肽序列，屬于雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)（Twin-arginine translocation, Tat）蛋白同源的分泌蛋白，在胞外行使催化功能。同時(shí)，他們?cè)谇杌浱幚砗骃fmE的缺失突變體發(fā)酵液中檢測(cè)到氰基化的長(zhǎng)鏈脂肪酰中間體（圖1，化合物7），隨后的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化和膜蛋白組分生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明蛋白SfmE解離了中間體的長(zhǎng)鏈脂肪酸，生成化合物3，發(fā)生前藥激活。他們同樣通過SfmCy2的體內(nèi)敲除及體外酶催化實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明其胞外脫氨修飾的酶學(xué)功能，并發(fā)現(xiàn)最終生成的羰基官能團(tuán)中氧來源于H2O。

該工作揭示了SFM-A生物合成中的前藥活化機(jī)制及獨(dú)特的胞外脫氨修飾機(jī)制，不僅補(bǔ)充了SFM-A生源合成路徑的最后一環(huán)，也是整個(gè)THIQ家族生物合成研究中的重要一步，為進(jìn)一步在分子水平上調(diào)控THIQ家族化合物的組合生物合成及合成生物學(xué)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

這一成果近期發(fā)表在Angewandte Chemie International Edition 上，宋立強(qiáng)博士、研究生章盈盈和蒲津越博士為并列第一作者。