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昆布二糖是β－1，3糖苷鍵連接的還原性二糖，是一種功能多樣的高價(jià)值寡糖。它可以作為合成透明質(zhì)酸的前體物質(zhì)應(yīng)用于制藥及化妝品行業(yè)，作為促發(fā)芽劑和天然防腐劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，且其具有益生作用，可以作為食品添加劑應(yīng)用于食品保健品行業(yè)，另外，還可以調(diào)控嗜熱菌熱纖維梭菌的蛋白表達(dá)。昆布二糖的傳統(tǒng)制備方法是以稀酸水解天然產(chǎn)物，但天然產(chǎn)物供應(yīng)有限，導(dǎo)致昆布二糖價(jià)格居高不下。因此，開(kāi)發(fā)成本低廉、環(huán)境友好的昆布二糖高效合成技術(shù)，對(duì)高附加值功能性寡糖生物制備具有重要意義。目前，昆布二糖的生產(chǎn)主要還是傳統(tǒng)的稀酸水解松針或者昆布等多糖。該工藝過(guò)程產(chǎn)率低、分離提取成本高，導(dǎo)致昆布二糖的價(jià)格居高不下。昆布二糖還能利用化學(xué)合成進(jìn)行制備，利用鹵素糖基作為糖基供體，通過(guò)來(lái)源于Koenigs-Knorr方法的O糖基化獲得昆布二糖。然而最終產(chǎn)品不容易純化，最終得率低于10％。隨著工業(yè)酶生物技術(shù)的發(fā)展，有科學(xué)家開(kāi)始嘗試酶法合成昆布二糖。日本科學(xué)家就利用3個(gè)酶(蔗糖磷酸化酶，葡萄糖異構(gòu)酶和昆布二糖磷酸化酶)，以蔗糖為底物生產(chǎn)昆布二糖，然而昆布二糖的得率只有50％左右，導(dǎo)致后續(xù)產(chǎn)品分離的成本較高。因此，亟待開(kāi)發(fā)一種低成本，低污染，高得率的昆布二糖酶制備方法。
通過(guò)體外多酶催化體系將淀粉和葡萄糖轉(zhuǎn)化為昆布二糖的催化途徑見(jiàn)圖。
其中涉及的關(guān)鍵酶包括：(1)淀粉磷酸化酶(αGP，EC2.4.1.1)，用于從淀粉上釋放出葡萄糖-1-磷酸；(2)昆布二糖磷酸化酶(LBP，EC2.4.1.31)，用于催化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖生成昆布二糖。高效液相色譜檢測(cè)昆布二糖的濃度。取反應(yīng)樣品94.5μL，加入5.5μL10％的硫酸終止反應(yīng)。離心取上清，采用HPLC檢測(cè)昆布二糖出峰面積和峰高計(jì)算昆布二糖的濃度。因昆布二糖磷酸化酶有可能催化葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸生成纖維二糖，所以首先對(duì)所使用的昆布二糖磷酸化酶專一性進(jìn)行鑒定。，昆布二糖保留時(shí)間為7.7-7.8分鐘，與葡萄糖、磷酸出峰時(shí)間都不重疊，但與纖維二糖出峰時(shí)間相近，為了確定產(chǎn)物只有昆布二糖，而無(wú)纖維二糖，采用薄層層析色譜進(jìn)行定性檢測(cè)，標(biāo)品纖維二糖和昆布二糖斑點(diǎn)位置并不重疊，可以進(jìn)行定性檢測(cè)，而反應(yīng)液樣品中出現(xiàn)與葡萄糖標(biāo)品對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，與葡萄糖-1-磷酸標(biāo)品對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，以及與昆布二糖標(biāo)品對(duì)應(yīng)的斑點(diǎn)，但是并未出現(xiàn)與纖維二糖標(biāo)品對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，由此可知，葡萄糖與葡萄糖-1-磷酸經(jīng)該昆布二糖磷酸化酶催化并無(wú)纖維二糖生成，因此，可以用高效液相色譜進(jìn)行昆布二糖定量。昆布二糖濃度與HPLC肌醇特征峰的響應(yīng)強(qiáng)度成正比。昆布二糖響應(yīng)強(qiáng)度逐漸增加，葡萄糖響應(yīng)強(qiáng)度逐漸下降。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算，昆布二糖的終濃度(圖4A)是23mM，相對(duì)淀粉(10g/L，約61.3mM葡萄糖當(dāng)量)轉(zhuǎn)化率為37.5％。
[1] 天津工業(yè)生物所在體外合成昆布二糖方面取得新進(jìn)展
[2] CN201711014505.3一種制備昆布二糖的方法