34096-83-8關(guān)于單葡萄糖醛酸甘草次酸的介紹

【概述】^[1]

甘草酸( Glycyrrhizin，GL) 不僅是甘草中的主要藥效成分，也是目前傳統(tǒng)中草藥甘草的重點(diǎn)研究方向。有研究表明，甘草酸( Glycyrrhizin，GL) 具有一定的抗炎、抗病毒、抗過敏、抗腫瘤、解毒等方面的作用。單葡萄糖醛酸甘草次酸( GAMG) 作為甘草酸的衍生物，只含有一分子葡萄糖醛酸，其極性介于甘草酸和甘草次酸之間，能順利進(jìn)入細(xì)胞，在機(jī)體內(nèi)的溶解度和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力比甘草酸和甘草次酸強(qiáng)。因而有更好的生物利用度。近20年內(nèi)，部分外國學(xué)者對GAMG的抗炎、抗過敏、抗癌等生理活性進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)研究，并對其抗癌功效的作用機(jī)制進(jìn)行了初步的探索，證實(shí)了18αGAMG 和18β-GAMG都有較強(qiáng)的抗癌作用。因此，開發(fā)GAMG作為一種高效新藥具有廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，GAMG作為一種較為安全的新型高倍甜味劑，在食品添加劑方面的應(yīng)用前景廣闊。

通過化學(xué)水解法制備 GAMG 時(shí)， 其對 β-1，2 糖苷鍵和β-1，3糖苷鍵的選擇性很低， 因此， 采用高能耗和高污染的化學(xué)法制備 GAMG 會生成大量的副產(chǎn)物甘草次酸。微生物法以其污染小、 成本低、 產(chǎn)率高、 副產(chǎn)物少等優(yōu)勢而得到更多研究者的青睞。我國對葡萄糖醛酸基甘草次酸的研究始于 20世紀(jì)中期，陸丁強(qiáng)等從鴨肝中篩選了葡萄糖醛酸苷酶能有效的將甘草酸水解生成產(chǎn) 物 GAMG， 李春等篩到一株紫青霉屬的微生物能定向的從甘草酸開始，去掉一分子葡萄糖醛酸生成 GAMG， 并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到80% 以上， 酶活為181.53 U /mL。但這些菌株的獲得量較少， 工業(yè)化生產(chǎn) GAMG 存在一定的困難。

【制備方法】^[1]

由于 GAMG 的制備工藝比較困難， 從而限制了其 應(yīng) 用。自 主 篩 選 出 能將GL特異性水解生產(chǎn)GAMG 的新的微生物菌株具有重要的意義。通過常壓室溫等離子體( ARTP) 誘變后， 篩選得到一株可水解GL生產(chǎn)GAMG 的藍(lán)狀真菌屬的有效菌株，且產(chǎn)率較高， 基本上無副產(chǎn)物生成。這不僅為工業(yè)化生產(chǎn) GAMG 提供了一個(gè)新方向， 也簡化工藝并降低生產(chǎn)成本， 為后續(xù)的放大實(shí)驗(yàn)及商業(yè)化生產(chǎn)提供新思路， 為后續(xù)將 GAMG 應(yīng)用于食品、 醫(yī)藥、 化妝品等工業(yè)領(lǐng)域奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)

1 菌株的篩選方法

1.1 富集培養(yǎng) 取 10.0 g 土樣溶于 10 mL 無菌水中充分混勻后， 接種 到 100 mL 富 集 培 養(yǎng) 基 中，30 ℃、 160 r /min 的搖床中培養(yǎng) 36 h。

1.2平板初篩 將富集液進(jìn)行無菌水梯度稀釋后，取1×10-5、 1 × 10-6、 1 × 10-7 三個(gè)稀釋梯度 100 μL稀釋液均勻涂布于選擇培養(yǎng)基平板上，28～30 ℃ 培養(yǎng)3 d，挑出在此平板上長出的單菌，并進(jìn)行分離純化。

1.3 搖瓶復(fù)篩 平板初篩的單菌株活化后， 以10% 的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中， 28 ℃、 160 r /min進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，8000 r /min 離心 15 min 后取發(fā)酵上清液進(jìn)行酶活測定， 檢測上述平板長出的菌株是否為 GAMG 產(chǎn)生菌，依據(jù)酶活高低篩選出產(chǎn) GAMG 的菌株。

2 β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-GUS) 活力的測定方法

移取 200 μL 粗酶液加入到 800 μL 含有甘草酸濃度2 mg /mL、 pH5.0 的醋酸－醋酸鈉緩沖溶液中，40 ℃ 條件下反應(yīng) 1 h 后，沸水浴中使酶失活， 取反應(yīng)液樣品過膜后在 HPLC 上檢測 GAMG 的含量。β-D-葡萄糖醛酸苷酶活力定義為在上述條件下，每小時(shí)生成1 μg的 GAMG 所需要的酶量為一個(gè)活力單位( U /mL) 。

3 常溫室壓等離子體誘變( AＲTP) 選育高產(chǎn)菌株

取活化好的有效菌株斜面， 用無菌生理鹽水洗下孢子， 采用無菌雙層擦鏡紙過濾， 即得單孢子懸液，涂布于金屬載片的表面上， 采用氦氣為工作氣體，設(shè)置處理功率為 120 W， 處理距離為 2 mm， 氣流量為 10 SLM， 對菌株進(jìn)行誘變， 處理時(shí)間為 30、 60、90、 120、 150、 180、 210、 240 s。選擇合適的菌落平板進(jìn)行計(jì)數(shù)來計(jì)算致死率，并繪制出致死曲線。同時(shí)挑取平板上的菌落進(jìn)行發(fā)酵測定酶活。致死率計(jì)算公式:致死率( % ) = ( U－T) /U × 100， 其中 U 為不經(jīng)誘變處理生長的菌落數(shù)，T 為經(jīng)誘變處理后生長的菌落數(shù)。

4 突 變 株 的 穩(wěn) 定 性 實(shí) 驗(yàn)

將 所 篩 選 的 高 產(chǎn)β－GUS的突變菌株接入 PDA 培養(yǎng)基中， 連續(xù)傳代 10次，測定每次傳代后菌株發(fā)酵后的 β－ GUS 活性， 觀察其遺傳穩(wěn)定性。

5 甘草酸和單葡萄糖醛酸甘草次酸的檢測方法

5.1 高效液相色譜( HPLC)

取發(fā)酵液上清用甲醇稀釋 10 倍后， 采用高效液相色譜( HPLC) 進(jìn)行測定。HPLC 檢測條件: 色譜柱: Agilent 的 C18 反相色譜柱( 4.6 mm × 250 mm) ，乙腈和 0.1% 的甲酸水為流動相， 流速為1.0 mL /min， 柱溫為25 ℃ ， 進(jìn) 樣 量 為10 μL，紫外檢測器，檢測波長 254 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作: 稱取 10 mg 在105 ℃ 中干燥至恒重的 GAMG 標(biāo)準(zhǔn)品至燒杯中， 加入少量甲醇至10 mL容量瓶中定容，得到 1.0 mg /mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。將其分別稀釋為 20、 40、 60、 80、 100μg /mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾，取樣 10 μL 進(jìn)行 HPLC檢測， 以 峰 面 積 ( mAU) 為 縱 坐 標(biāo)， GAMG 的 濃 度( μg /mL) 為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 其線性回歸方程為: y =7.4898x－77.1828，R2=0.9957，表明相關(guān)性良好。

5.2 液質(zhì)聯(lián)用( LC－MS)

將發(fā)酵液樣品用甲醇進(jìn)行適當(dāng)稀釋過膜后， 采用電噴霧電離源， 負(fù)離子模式。通過 WATERS MALDI SYNAPT Q－TOF MS 對樣品進(jìn)行測定。

5.3 紅外吸收光譜的測定

在半制備高效液相色譜上，進(jìn)樣 100 μL 上清液， 收集相應(yīng)的產(chǎn)物樣品，減壓蒸餾， 冷凍干燥，將得到的樣品在 NICOLET IS5型紅外光譜儀上用 KBr 壓片法進(jìn)行測定。

5.4 核磁共振( NMR) 將半制備高效液相色譜

上收集 所 得 的 產(chǎn) 物 樣 品 和 GAMG 標(biāo) 品 分 別 溶 于500 μL的氘代甲醇中， 采用 AVANCE III 400 型核磁共振儀在 25 ℃下進(jìn)行測定。

【鑒定】^[1]

將 ARTP 誘變后酶活提高明顯的目的菌株 G39，通過 LC－MS、 FT－IR、 NMR的測定技術(shù)對該菌株發(fā)酵液的主要代謝產(chǎn)物進(jìn)行物質(zhì)鑒定以檢測所篩選的菌株對甘草酸的轉(zhuǎn)化結(jié)果。

1 質(zhì)譜表征

取發(fā)酵上清樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用的測定，采用電噴霧電離源， 負(fù)離子模式。電噴霧是一種軟電離源，通常很少或沒有碎片， 譜圖中只有準(zhǔn)分子離子，因而只能提供未知化合物的分子量信息， 不能提供結(jié)構(gòu)信息。由圖 3 可知，保留時(shí)間為 1.67 min的物質(zhì) A 的分子量為 822， 其為甘草酸， 保留時(shí)間為2.49 min 的物質(zhì) B 的分子量為 646， 為發(fā)酵的主產(chǎn)物GAMG。亦沒有副產(chǎn)物甘草次酸的生成。

2 紅外表征

樣品經(jīng)預(yù)處理后， 其 FT-IR圖譜如圖 4 所示，分析可知，750 cm^-1 和 1375 cm^-1附近為有 C－H 吸收峰，1630～1680 cm^-1 附近有 C = O 吸收峰，2420 cm ^-1和 3450 cm ^-1附近有 O－H 吸收峰， 這與GAMG 中存在的吸收峰類型相符。

3 核磁共振

樣品的核磁信息如圖 5 所示，δH( 400 MHz, MeOD) 5.47 ( 1H,s),4.28 ( 1H,d,J 7.7),1.32( 3H,s),1.07( 3H,s),1.04( 6H,s),0.97( 3H,s),0.78( 3H,s),0.74 ( 3H,s) 。

GAMG 標(biāo)品的核磁信息為δH( 400 MHz,MeOD) 5.48 ( 1H,s) ,4.28 ( 1H, d， J7.8),1.32 ( 3H,s) ,1.07 ( 3H,s),1.05 ( 3H,s),1.04( 3H,s),0.97( 3H,s),0.78( 3H,s), 0.74( 3H,s) 。這些分子結(jié)構(gòu)及反應(yīng)特征的圖譜表明， 發(fā)酵生產(chǎn)所制備的主產(chǎn)物為 GAMG。

【參考資料】

[1]郭立純,趙偉.產(chǎn)單葡萄糖醛酸甘草次酸菌株的篩選及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技,2017,38(16):88-94.