3326-32-7/異硫氰酸熒光素酯在pH熒光化學(xué)傳感器中的應(yīng)用

背景及概述^[1]

異硫氰酸熒光素酯是黃色粉末，有吸濕性，能與各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中仍有強(qiáng)烈綠色熒光，加酸后析出沉淀，熒光消失，微溶于丙酮、乙醚和石油醚。異硫氰酸熒光素酯是生化試劑，也是醫(yī)學(xué)診斷藥物，主要用于熒光抗體技術(shù)中的熒光染料，能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的綠色熒光。其用于醫(yī)學(xué)，農(nóng)學(xué)和畜牧等方面，可對(duì)由地細(xì)菌病毒和寄生蟲等所致疾病進(jìn)行快速診斷。

應(yīng)用 ^[1]

異硫氰酸熒光素酯用于合成一種pH熒光化學(xué)傳感器：

pH值是水溶液最重要的物理化學(xué)參數(shù)之一，凡涉及水及溶液的自然現(xiàn)象、化學(xué)變化以及 生產(chǎn)過程都與pH有關(guān)。在生物體系中，pH值在一些生理過程中發(fā)揮著重要的作用，比如細(xì)胞的增值、酶的活性、離子傳輸、癌細(xì)胞的生存狀態(tài)等等(J.Am.Chem.Soc.，2009，131，3016； Chem.Rev.，2010，5，2709)。因此，pH值的測(cè)定一直以來就是工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、科學(xué)研究、臨床醫(yī)學(xué)及環(huán)境保護(hù)與監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域必不可少的工作。

pH玻璃電極因存在阻抗高，較難微型化、較易破損、不能用于含HF溶液pH測(cè)定，存在“鈉誤差”和“酸誤差”等缺陷，使它在細(xì)胞內(nèi)的pH 值檢測(cè)和細(xì)胞成像研究方面的應(yīng)用受到了限制。與電化學(xué)檢測(cè)方法相比，基于熒光探針的光 學(xué)檢測(cè)方法就克服了以上缺點(diǎn)(Chem Rev.，1997，97，1515；Chem Rev.，2003，103，4419.)。熒光傳感器因具有靈敏度高，選擇性好，檢測(cè)限低，儀器操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)受到了廣大科研工作者的 青瞇(Chem Commun.，2008，45，5915；Inorg Chem.，2010，49，10753；Anal Bioanal Chem.，2005， 383，349；Chem Soc Rev.，2011，40，79.)。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的pH化學(xué)傳感器只有為數(shù)不多的可用于定量檢測(cè)和細(xì)胞成像(J.Am.Chem.Soc.，2010，132，13951；J.Mater.Chem.，2011，21， 4056.)。目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種生物相容性好、具有特定光學(xué)響應(yīng)的高靈敏pH熒光化學(xué)傳感器。本發(fā)明的pH熒光化學(xué)傳感器結(jié)構(gòu)中引入了聯(lián)吡啶基團(tuán)和異硫氰酸酯熒光素(Fluorescein isothiocyanate isomer I，F(xiàn)ITC)，聯(lián)吡啶基團(tuán)上含有N原子，易質(zhì)子化，作為鍵合基，F(xiàn)ITC作為熒光團(tuán)，具有水溶性好、量子產(chǎn)率高、熒光響應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)。CN201210587177.7提供一種高靈敏的pH熒光化學(xué)傳感器，包括聯(lián)吡啶分子骨架、氫離子鍵合單元、和信號(hào)傳輸單元異硫氰酸酯熒光素?zé)晒鈭F(tuán)；其中，所述pH熒光化學(xué)傳感器如式(I)所示：

其中，X為S或O元素；R為具有熒光性質(zhì)的化學(xué)基團(tuán)。進(jìn)一步地，R為異硫氰酸酯熒 光素(FITC)、蒽、芘或者它們的衍生物。

本發(fā)明還提供了所述pH熒光化學(xué)傳感器的制備方法，是以聯(lián)吡啶分子骨架為基礎(chǔ)，同時(shí)引入一個(gè)氨基和一個(gè)熒光團(tuán)，從而使其在水溶液中對(duì)pH具有特定的熒光響應(yīng)。具體而言，以聯(lián)吡啶分子為分子骨架，在其四位上分別引入氨基、熒光素基，聯(lián)吡啶分子上的兩個(gè)氮原 子和氨基作為鍵合位點(diǎn)，熒光素基作為信號(hào)單元，合成pH熒光化學(xué)傳感器。其反應(yīng)路線如下：

合成實(shí)施例如下：

實(shí)施例1：含異硫氰酸酯熒光素的pH熒光化學(xué)傳感器的合成

(1)合成在聯(lián)吡啶分子的四位上引入氨基的衍生物：

第一步：在50mL的圓底燒瓶中加入1.0g(1.6mmol)4，4’-二溴甲基-2，2’-聯(lián)吡啶，960 mg(14.77mmol)NaN3和20mL的二甲基亞砜(DMSO)，反應(yīng)液在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢柽^夜。 反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液用150mL乙醚稀釋，100mL蒸餾水水洗，分別收集有機(jī)相和水相。 水相用50mL乙醚萃取三次，合并有機(jī)相。然后有機(jī)相用50mL蒸餾水洗滌三次，100mL 飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鎂干燥，過濾，濾液旋干，得白色固體4，4’-二疊氮甲基-2，2’- 聯(lián)吡啶773mg，產(chǎn)率99％。¹HNMR (500MHz，DMSO-d6)δ：8.70(d，J＝7.5Hz，2H，-bipyH)， 8.38(s，2H，-bipyH)，7.33(d，J＝7.5Hz，2H，-bipyH)，4.51(s，4H，-CH2)，MS(ESI)：C12H10N8 +Na 289.1。

第二步：將0.22g(0.83mmol)4，4’-二疊氮甲基-2，2’-聯(lián)吡啶溶于20mL干燥的四氫呋喃 (THF)中，再迅速加入1mL三乙胺和20mg 10％的鈀碳，通氮?dú)馀趴杖危烦獨(dú)夂笥?氫氣排凈氮?dú)?。在氫氣氣氛下反?yīng)48小時(shí)，過濾，濾液旋干，得白色固體4，4’-二氨甲基-2，2’- 聯(lián)吡啶170mg，產(chǎn)率96％。¹HNMR (500MHz，DMSO-d6)δ：8.54(d，J＝7.50Hz，2H，-bipyH)， 8.28(s，2H，-bipyH)，7.22(d ，J＝7.5Hz，2H，-bipyH)，3.91(s，4H，-CH2)，1.54(s，4H，-NH2) MS(ESI)：C12H10N8+H 215.2。

(2)基于聯(lián)吡啶的pH熒光化學(xué)傳感器分子的合成

向20mL干燥的二氯甲烷和甲醇的混合溶劑(v∶v＝10∶10)中加入異硫氰酸酯熒光素，再向混 合溶液中慢慢加入20mL含27mg(0.126mmol)4，4’-二疊氮甲基-2，2’-聯(lián)吡啶溶液 (v(DCM)∶v(CH3OH)＝10∶10)。滴加完畢后，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫?cái)嚢柽^夜，反應(yīng)液中有大量沉淀產(chǎn) 生。過濾，沉淀采用索氏提取器(萃取劑是50mL的二氯甲烷和甲醇的混合溶劑，v∶v＝1∶1)， 萃除可溶性雜質(zhì)，得橘紅色固體，為pH熒光化學(xué)傳感器34mg，產(chǎn)率50％。¹HNMR(500MHz， DMSO-d6)δ：3.86(s，2H，-CH2)，4.92(s，2H，-CH2)，6.53-6.64(m，6H，-FITCH)，7.18(d，J＝8.2Hz，1H，-ArH)，7.40(d，J＝4.3Hz，2H，-bipyH)，7.78(d，J＝7.7Hz，1H，-ArH)，8.27(s，1H， -ArH)，8.36(d，J＝13.4Hz，1H，-bipyH)，8.40(d，J＝7.6Hz，1H，-bipyH)，8.58(d，J＝5.1Hz，1H，-bipyH)，8.63(d，J＝4.9Hz，1H，-bipyH)，8.76(s，H，-NH)，MS(ESI)：C33H25N5O5S+H 604.38。

主要參考資料

[1] CN201210587177.7 一種pH熒光化學(xué)傳感器及其合成方法和應(yīng)用