327-97-9 / 綠原酸的應(yīng)用

背景及概述^[1][2]

綠原酸( chlorogenic acid)，又名咖啡鞣酸、咖啡單寧酸，化學(xué)名 3-O-咖啡?？崴?，是由咖啡酸( caffeic acid) 與奎尼酸( quinic acid) 形成的縮酚酸。綠原酸是一種分布廣泛且具有諸多藥理活性的天然化合物，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生及食品化工等行業(yè)。但目前我國在綠原酸的生物合成、藥理活性以及開發(fā)利用等方面的研究仍較為滯后。我國具有豐富的富含綠原酸的植物資源，而目前綠原酸的主要來源是從天然植物中提取，如金銀花、杜仲、咖啡豆以及向日葵等。

但是對于任何一種天然化合物，單純依靠天然植物資源，均不利于可持續(xù)發(fā)展。因此，擴大其來源途徑勢在必行。目前已針對綠原酸的資源植物金銀花開展了一系列的實驗工作，包括金銀花離體再生體系的建立、金銀花懸浮細胞培養(yǎng)體系的建立、金銀花綠原酸合成關(guān)鍵酶HQT 基因的克隆、表達以及功能鑒定、HQT 基因的過表達以及表達沉默研究等。這些研究的成功開展將為擴大綠原酸的來源途徑、提高金銀花的藥材質(zhì)量、科學(xué)合理的開發(fā)利用綠原酸以及為揭示綠原酸生物合成的分子機制提供理論和技術(shù)支持。

結(jié)構(gòu)

分布^[1]

綠原酸在植物界的分布十分廣泛，從雙子葉植物到蕨類植物都有分布，主要存在于忍冬科忍冬屬( Lonicera) 、菊科蒿屬 ( Artemisia) 等植物中。在杜仲、金銀花、咖啡、菊花等植物中的含量非常高。此外，馬鈴薯、胡蘿卜、菠菜、蘋果等蔬菜水果中也含有綠原酸。綠原酸的分布受產(chǎn)地、土壤質(zhì)地、氣候因子等外
部因素以及發(fā)育階段、基因型、器官部位等內(nèi)部因素的影響。就外部因素而言，在產(chǎn)地方面，研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地野菊花以及山銀花中綠原酸含量差異顯著。

在土壤質(zhì)地方面，研究均顯示不同土壤質(zhì)地對杜仲以及夏臘梅等植物中綠原酸含量具有一定的影響。就內(nèi)部因素而言，不同的發(fā)育階段對于元寶楓葉以及杭白菊中的綠原酸含量均產(chǎn)生一定的影響，采自 8 月份的元寶楓葉片中綠原酸含量最高，而花蕾期的杭白菊中綠原酸含量最高，胎菊期次之此外，植物的不同器官部位綠原酸的分布也有顯著差異。綜上，綠原酸的分布受諸多因素的影響，具有較復(fù)雜的生物學(xué)機制。對其分布進行深入的研究，對于科學(xué)合理的開發(fā)綠原酸資源具有重要的意義。

理化性質(zhì)^[1]

綠原酸化學(xué)名為 3-O-咖啡?？崴幔肿邮綖镃₁₆H₁₈O₉，分子量為 354. 30。其半水合物為白色或黃色針狀結(jié)晶。在110 ℃時成為無水物，熔點206 ～ 208 ℃，比旋光度［α］ D = 35. 2°( C = 2. 8) 。在25 ℃時水中溶解度較低，約為 4%，在熱水中溶解度會增大，且溶解度隨溫度而變化。易溶于乙醇、丙酮、甲醇; 微溶于乙酸乙酯; 難溶于氯仿、乙醚、苯等親脂性有機溶劑。綠原酸為極性有機酸，不太穩(wěn)定，在提取過程中易發(fā)生異構(gòu)化。

綠原酸分子結(jié)構(gòu)中含有的鄰二酚羥基，是酚酶催化最適的反應(yīng)底物，受熱、見光易氧化，這也是許多含有綠原酸成分的水果如桃、蘋果等褐變的關(guān)鍵原因，因此應(yīng)在陰涼、避光條件下保存。在堿性條件下，綠原酸可發(fā)生水解，成為綠色醌類。植物體內(nèi)存在的綠原酸往往是混合物而非單一組分，包括單咖啡酰奎尼酸、雙咖啡酰奎尼酸、三咖啡?？崴帷⒕G原酸甲酯。

生理活性及應(yīng)用^[1]

1. 心血管保護作用

氧自由基是引起內(nèi)皮損傷的重要因子之一，而大量的實驗證明綠原酸是一種自由基清除劑及抗氧化劑 〔23，24〕，它通過清除氧自由基及抗脂質(zhì)過氧化，可保護血管內(nèi)皮細胞，進而對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生有效的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)綠原酸對心肌細胞能起到保護作用。

2. 抗氧化作用

綠原酸分子中的活性羥基可以形成具有抗氧化作用的氫自由基，從而消除羥基自由基的活性，保護組織免受氧化作用的損傷?？赡芘c綠原酸可以抑制 DNA 受到活性氧攻擊時形成8-OH-dG 有關(guān)。

研究顯示，綠原酸具有清除自由基的作用，且清除效果與其濃度呈劑量關(guān)系。其他的一些研究也證明，在綠茶、咖啡以及茵陳中提取的綠原酸均可以起到很好的抗氧化作用。

3. 抗紫外和抗輻射作用

研究發(fā)現(xiàn)以綠原酸為代表的天然多酚物質(zhì)，可以保護膠原蛋白不受活性氧等自由基傷害，有效防止紫外線對人體皮膚產(chǎn)生傷害作用。目前已有多項添加綠原酸后用于皮膚防曬霜和洗發(fā)水的歐洲專利，這些產(chǎn)品對于抗輻射均具有一定的作用。

4. 抗誘變及抗癌作用

大量的實驗均證明綠原酸具有抗誘變及抗癌的作用。如: 蔬菜、水果中的綠原酸可通過抑制活化酶來抑制致癌物黃曲霉毒素B1 和苯并［a］芘的變異原性; 綠原酸在堿性環(huán)境下能導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生較大的 DNA 碎片，并引起核凝集; 綠原酸能抑制 4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO) 誘導(dǎo)的 8-羥基脫氧鳥苷( 8-OH-dG) 的增高，而后者是癌變和細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中的重要物質(zhì)。綠原酸還可通過降低致癌物的利用率及其在肝臟中的運輸來達到防癌、抗癌的效果。

5. 抗菌及抗病毒作用

在抗菌方面，目前的研究普遍認為綠原酸具有很好的抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、軍團菌等細菌的作用，如別對金銀花中的提取物綠原酸進行抗菌實驗發(fā)現(xiàn)，綠原酸具有良好的抗金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌的活性。

對煙草中的綠原酸進行抑菌試驗也發(fā)現(xiàn)綠原酸除了具有抗金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌的活性之外，對枯草芽孢桿菌也具有抑制作用。其抗菌機制可能與非競爭性抑制細菌體內(nèi)的芳基胺乙酰轉(zhuǎn)移酶有關(guān)。在抗病毒方面，研究發(fā)現(xiàn)從返魂草提取物中獲得的綠原酸對流感病毒、呼吸合胞病毒及腺病毒均具有抑制作用。

6. 降脂作用

研究表明口服綠原酸有降低大鼠內(nèi)臟脂肪堆積和體脂量的趨勢。綠原酸 5mg /mL 靜脈給藥，連續(xù) 3 周，可使大鼠血漿中膽固醇以及甘油三酯分別下降 44%。研究發(fā)現(xiàn)金銀花提取物能降低血清和肝組織均有所下降。

7. 抗白血病作用

就綠原酸對白血病細胞的抑制作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)-20 ℃避光保存的氯原酸鈉可以選擇性抑制 bcr-abl 陽性的白血病細胞系 K562 細胞的增殖。而4 ℃保存的氯原酸鈉對 bcr-abl 陽性的白血病細胞系 K562 的增殖抑制作用增強，并且對 bcr-abl 陰性的 Jurkat 細胞亦具有增殖抑制作用。在其對大血藤中酚類化合物進行抗腫瘤活性篩選時發(fā)現(xiàn)綠原酸對人慢性髓白血病 K562 細胞具有抑制作用。

8. 免疫調(diào)節(jié)作用

研究發(fā)現(xiàn)綠原酸對上皮內(nèi)淋巴細胞( IEL) 上清液以及腸道固有層淋巴細胞( LPL) 上清液中 NF-γ 和 TNF-α 水平影響均較大。體外研究顯示綠原酸可顯著增強流感病毒抗原引起的 T 細胞增殖，并且能誘導(dǎo)人淋巴細胞及人外周血白細胞生成 IFN-γ 和 IFN-α。

此外，綠原酸亦能提高大鼠體內(nèi)的 IgE、IgG1 和 IL- 4 的水平。綠原酸能夠增強巨噬細胞的功能。因此，綠原酸具有一定的免疫調(diào)節(jié)能力。

9. 降血糖作用

對綠原酸的降血糖藥效學(xué)進行了研究，發(fā)現(xiàn)綠原酸粗提物可有效降低四氧嘧啶型糖尿病小鼠血糖，且給藥后高、中、低劑量組間血糖值無顯著性差異，說明該藥物無劑量依賴性。但其對正常小鼠的血糖無明顯影響。金銀花提取物可降低蔗糖性高血糖小鼠和四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖。

此外，研究也顯示，3 h內(nèi)綠原酸的降糖效應(yīng)與格列本脲無統(tǒng)計學(xué)差異。其機制可能與抑制葡萄糖- 6-磷酸位移酶和葡萄糖吸收有關(guān)。

10. 其它

除以上諸多的藥理活性之外，綠原酸還具有抗炎活性，據(jù)報道，綠原酸類物質(zhì)可以通過抑制透明質(zhì)酸酶 ( HAase) 的活性而起到消炎的作用。此外，綠原酸尚具有保肝利膽、解痙之功效。

含量測定^[3]

HPLC法

(1) 色譜條件用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑; 乙腈-0.4%磷酸溶液 (13：87) 為流動相; 檢測波長為327nm。理論板數(shù)按綠原酸色譜峰計大于1000。

(2) 對照品溶液的配制精密稱取綠原酸對照品適量，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成每毫升含40μg的溶液，即得 (10℃以下保存)。

(3) 樣品溶液的制備取樣品干燥粉末約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加50%甲醇50ml，稱定重量，超聲處理30min，放冷，稱重，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液5ml，置25ml棕色量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，即得。

(4) 測定分別精密吸取對照品與樣品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定，即得。

(5) 色譜圖

C.綠原酸

(6) 測定結(jié)果通過十多批樣品測定，確定金銀花中綠原酸的含量不少于1.5%。

制備^[1]

目前公認的綠原酸可能合成途徑有三條，如圖所示：

其中途徑 1 可能是作為在 HQT活性較低的細胞器內(nèi)合成綠原酸的途徑。關(guān)于途徑 2，由于在擬南芥細胞中 HCT和 C3' H (p-coumarate 3'-hydroxlase) 活性都很高的情況下，并未有發(fā)現(xiàn)綠原酸，說明途徑 2 可能不是植物大量合成綠原酸的主要途徑。目前大量的證據(jù)均支持途徑 3，即通過 HQT合成綠原酸的途徑可能是其主要的合成途徑。

主要參考資料

[1]鄧良, 袁華, & 喻宗沅. (2005). 綠原酸的研究進展.化學(xué)與生物工程,22(7), 4-6.

[2] 吳衛(wèi)華, 康楨, 歐陽冬生, & 周宏灝. (2006). 綠原酸的藥理學(xué)研究進展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā),18(4), 691-694.

[3]天然藥物成分定量分析