2768-90-3/胰島素原的復(fù)性與純化

概述^[1][2]

胰島素原具有與胰島素相同的生物學(xué)作用，但其生理活性比胰島素弱，只有胰島素的3%～5%。然而，胰島素原的半壽期較長，約17.2分鐘，注入人體后的生物活性比胰島素持久。

胰島素原是胰島素的前身物，其分子結(jié)構(gòu)為一條86個(gè)氨基酸殘基組成的直鏈多肽。在生理情況下，胰島素原分泌很少，占胰島素樣物質(zhì)總量的5%～10%，但由于胰島素原的代謝清除率低于胰島素，前者為18～20min，而后者則為10～12min，故周圍血中胰島素原在胰島素樣活性物質(zhì)中所占的比例略高于其實(shí)際比例，為10%～15%。

制備^[3]

重組人胰島素原的制備

將Streamline Q XL灌注擴(kuò)張床層析柱(Streamline 100層析柱，GE)，用流動相Ⅰ(10mM Tris?HCl，pH9.0)平衡，從擴(kuò)張床底部向上進(jìn)液，流速調(diào)整為200cm/h，使擴(kuò) 張床樹脂擴(kuò)張到固定床體積的1倍，平衡約3個(gè)柱體積；

開始上樣含重組人胰島素原的大腸桿菌表達(dá)包涵體復(fù)性液50L，從擴(kuò)張床底部向上進(jìn)液，調(diào)整上樣流速為1000cm/h。使擴(kuò)張床樹脂擴(kuò)張到固定床體積的5倍；

上樣完畢，用流動相Ⅱ(10mM Tris?HCl，pH9.0，0.5M NaCl)洗滌，從擴(kuò)張床底部 向上進(jìn)液，流速調(diào)整為1000cm/h，使擴(kuò)張床樹脂擴(kuò)張到固定床體積的5倍，洗滌約10個(gè) 柱體積；

洗滌完畢，停泵，使樹脂自然沉降，然后將柱頂下降至樹脂表面并壓緊樹脂，從擴(kuò)張 床頂部向下進(jìn)液，流速調(diào)整為50cm/h，用流動相Ⅱ(10mM Tris?HCl，pH9.0，0.5M NaCl)： 流動相Ⅲ(10mM Tris?HCl，pH9.0，1.0M NaCl)開始梯度洗脫，梯度洗脫程序?yàn)?0％～100％流動相Ⅲ梯度洗脫5個(gè)柱體積，收集洗脫峰。

經(jīng)檢測并計(jì)算，重組人胰島素原的收率為89.2％，純度為91.3％。

復(fù)性與純化^[4]

（1）重組人胰島素原變性抽提液的準(zhǔn)備

用E.coli作為宿主細(xì)胞表達(dá)重組人胰島素原(rhPI)蛋白，再將發(fā)酵菌液經(jīng)離心、細(xì)胞破碎和分別用緩沖液Ｉ（20 mmol/L PBS，1 mmol/L EDTA，pH 7.4）和II（2.0 mol/L脲，1 mmol/L EDTA，1.0 mol/L NaCl，20 mmol/L PBS，pH 7.4）洗滌、并離心的粗純化后，得到的包涵體溶于8.0mol/L脲，20 mmol/LDTT，1.0 mmol/LEDTA，pH 8.0（或6～7 mol/L鹽酸胍，10～20mmol/LDTT，0.5～1mmol/LEDTA，pH7.0～8.0）的變性劑中，變性抽提液濃度為9.92 mg/mL，rhPI純度為65.7 %以上，電泳見圖1中條帶3。

（2）高效體積排阻色譜復(fù)性與純化重組人胰島素原

用流動相A（20 mmol/ LPBS，4.0mol/L 脲，pH6.5）平衡 HPSEC柱(TSK gel G2000SWXL，300 ×7.8 mm I.D.)，變性抽提液直接進(jìn)樣200 μL，在流速0.3 mL/min下進(jìn)行30 min的線性梯度洗脫, 直至流動相B（20 mmol/L PBS，pH 6.5）為100%, 延長10 min。rhPI質(zhì)量回收率為42.5%，純度達(dá)到95%以上，色譜圖見圖2（A）的曲線3，質(zhì)量回收率見圖2（B）中。

（3）用脫鹽色譜柱二次純化重組人胰島素原

用0?10 mmol/LPBS，pH6.0?7.0的流動相平衡的脫鹽色譜柱（HiTrap Desalting column），對復(fù)性與純化得到的含人胰島素原的色譜餾分I直接進(jìn)樣，持續(xù)洗脫30 min，流速1.0ml/min。rhPI的純度達(dá)到了99%以上。見圖1中條帶5。

主要參考資料

[1] 協(xié)和醫(yī)學(xué)詞典

[2] 內(nèi)科學(xué)·第二卷

[3] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)] CN201110406282.1 一種制備重組人胰島素原的方法

[4] [中國發(fā)明] CN201310065815.3 重組人胰島素原的復(fù)性與純化方法