2646-71-1 / NADPH的分離純化方法和制備方法

背景及概述^[1]

NADPH即還原型輔酶，學(xué)名：還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(triphosphopyridine nucleotide)，是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)中與腺嘌呤相連的核糖環(huán)系2'-位的磷酸化衍生物，在很多生物體內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)中起遞氫體的作用，并且參與多種代謝反應(yīng)的合成，如脂類、脂肪酸和核苷酸的合成，還可以在暗反應(yīng)中為二氧化碳的固定進(jìn)行供能。在上述反應(yīng)中， NADPH是NADP+的還原形式，NADPH的作用是還原劑和氫負(fù)離子的供體；同時，NADPH是細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成成分，在細(xì)胞防御活性氧(ROS)損傷方面起著重要的作用。

有文獻(xiàn)報道，細(xì)胞的生長、分裂、分化、遷移、凋亡及衰老等許多生命活動，也與NADPH密切相關(guān)；而且，維持NADPH(NADH)的固定濃度，或者外加輔助的NADPH(NADH)，可以對抗細(xì)胞的凋亡和衰老過程，延緩機(jī)體衰老。最新的研究發(fā)現(xiàn)，NADPH和NADH在機(jī)體生理與病理?xiàng)l件下都發(fā)揮重要的功能。當(dāng)前，對細(xì)胞內(nèi)NADPH(NADH)作用和代謝的研究已成為國際性的研究熱點(diǎn)。

分離純化方法^[1]

NADPH的分離純化方法，包括以下步驟：

將NADPH粗品溶液采用0.45μm微孔濾膜進(jìn)行過濾，得供試品溶液；將所述供試品溶液通過反相柱層析純化，反相柱層析的介質(zhì)為C18，顆粒度為 10μm，粒徑為色譜柱為Sepax GP-C18，以10mM NaH2PO4緩沖液為流動相A，以體積分?jǐn)?shù)為100％的甲醇為流動相B，先用體積分?jǐn)?shù)為100％的甲醇進(jìn)行活化洗脫30min，再用A：B的體積比為95％：5％的流動相進(jìn)行平衡洗脫 35min，然后按照如下程序進(jìn)行梯度洗脫：0-10min，A：B的體積比為95％：5％；10-40min，A：B的體積比為90％：10％；40-60min，A：B的體積比由90％：10％→40％：60％；60min，A：B的體積比為60％：40％，柱溫為 15℃，流速為40mL/min，檢測波長為260nm，HPLC檢測，收集，濃縮，干燥，即得。

本實(shí)施例整個分離純化過程僅需3小時即可完成，收率為55％。

制備方法^[2]

一種固定化酶催化制備NADPH的工藝，包括如下步驟：

1)用磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀分別配置0.1mol/L和0.2mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 6.8－7.2)，備用。

2)配置1.25mol/L的氫氧化鈉溶液，備用。

3)將130g硅膠加入到300mL、0.2mol/L的磷酸緩沖溶液中浸泡12h；浸泡后，清洗硅 膠：去除上清液，將130g浸泡后的硅膠加入300mL、0.2mol/L的新鮮磷酸緩沖溶液，震蕩 3min，靜置2min，更換緩沖液，清洗硅膠的步驟重復(fù)4次。

4)將處理好的硅膠置于73g GDH溶液(14.6g GDH用0.1mol/L磷酸緩沖溶液稀釋5 倍，GDH的比活力為600u/mg)中，并在25℃下吸附固定55min，得到固定化GDH。

GDH的固載率測定：采用考馬斯亮藍(lán)法，測出固定前游離酶含量、固定后上清液游 離酶含量，測出GDH的固載率為60％。

5)取200g葡萄糖和10g氧化型NADP+，用0.1mol/L磷酸緩沖溶液定容至1000mL，備 用。

6)取一燒杯向其中加入580mL上述混合溶液和步驟4中固定的GDH，于37℃下保溫 攪拌反應(yīng)，并滴加氫氧化鈉溶液維持pH＝7.0。

7)實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)反應(yīng)時間為15min時，NADPH-Na4生成量為4.008g，15min后，NADPH- Na4的合成速率顯著下降。

參考文獻(xiàn)

[1] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權(quán)] CN201611089629.3 一種NADPH的分離純化方法

[2] [中國發(fā)明] CN201810430317.7 一種硅膠固定GDH催化制備NADPH的方法