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D-熒光素是一種依賴腺苷三磷酸(ATP)生物發(fā)光反應(yīng)的底物，生物發(fā)光的原理是熒光素在ATP和氧存在條件下被熒光素酶氧化，其化學(xué)反應(yīng)式如下： ATP+D-Luciferin+O2→Oxyluciferin+AMP+PPi+O2+Light。熒光素/熒光素酶的生物發(fā)光反應(yīng)常用于ATP、能轉(zhuǎn)化為ATP的代謝物(如AMP、ADP、cAMP)和能產(chǎn)生ATP的酶(如肌酸激酶等)的檢測，因此生物發(fā)光反應(yīng)可應(yīng)用于廣泛范圍內(nèi)生物材料的檢測。近幾十年來，ATP 生物發(fā)光技術(shù)得到了很大的發(fā)展，已經(jīng)在細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和生物量計(jì)數(shù)等方面廣泛應(yīng)用。 在食品衛(wèi)生領(lǐng)域由于ATP生物發(fā)光技術(shù)無需培養(yǎng)過程，操作簡便、靈敏度高，數(shù)分鐘內(nèi)可得 到結(jié)果，具有其它微生物檢測方法無法比擬的優(yōu)勢(shì)，是目前檢測微生物最快的方法。除此之外，熒光素酶基因可作為報(bào)告基因，在分子生物學(xué)上有廣泛的應(yīng)用。因此熒光素/熒光素酶生物發(fā)光反應(yīng)具有很大的市場，D-熒光素作為生物發(fā)光反應(yīng)的底物，隨著ATP生物發(fā)光反應(yīng)試劑需求的增加，其需求量越來越大。
D-熒光素的反應(yīng)原材料為2-氰基-6-甲氧基苯并噻唑(99％，NEW JERSEY，USA 1-800-ACROS-01)和鹽酸吡啶(98％，ACROS ORGANICS)，反應(yīng)比例為2-氰基-6-甲氧基苯 并噻唑∶鹽酸吡啶＝1∶1～3，反應(yīng)溫度為180～250℃，環(huán)境為抽真空通氮?dú)猓磻?yīng)時(shí)間為0.5～3h。
脫甲基反應(yīng)后的產(chǎn)物用1∶1～3的乙酸乙酯和冰水洗滌反應(yīng)后的混合物三次，每次的用量 約為反應(yīng)原材料的50～100倍。通過萃取有機(jī)層后用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮干燥。
脫甲基后的目標(biāo)產(chǎn)物純化是用80～400目的粗孔硅膠進(jìn)行柱層析，層析柱最好用帶三通的 可加壓式層析純化柱。用體積比5∶1～3氯仿/乙酸乙酯做洗脫溶劑，對(duì)直徑為25mm，高為 250mm的層析柱，洗脫流速為1～10ml/min，通過HTLC(高效薄層層析)檢測，收集目標(biāo)產(chǎn) 物濃度的較高部分，合并之后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)濃縮干燥。
純化后的脫甲基產(chǎn)物與D-半胱氨酸水合物在堿性混合溶劑中于室溫下避光反應(yīng) 10～30min，用鹽酸調(diào)pH值至1～6，通過1000～15000r/min室溫條件下離心10～20min，收集 沉淀，并將此沉淀在真空條件下干燥，即可得D-熒光素粗品。
CN201410013473.5公開一種檢測飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量和GMP工廠表面衛(wèi)生的ATP生物發(fā)光試劑、方法及試劑盒。本發(fā)明所述的ATP生物發(fā)光試劑，包括熒光素酶、D-熒光素、去ATP無菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)，所述的熒光素酶必須經(jīng)過純化，純化的熒光素酶的活力本底比達(dá)到50~3000，其使得ATP生物發(fā)光試劑的發(fā)光比活力在0.4mL發(fā)光體系中，用1×10-7/L ATP測量時(shí)的相對(duì)發(fā)光對(duì)數(shù)值達(dá)到6.5~7.5，將熒光素酶、D-熒光素、去ATP無菌處理的發(fā)光穩(wěn)定緩沖系統(tǒng)混合后冷凍得到凍干粉。本發(fā)明采用高靈敏度穩(wěn)定發(fā)光的ATP生物發(fā)光試劑對(duì)飲用水衛(wèi)生質(zhì)量及GMP工廠表面衛(wèi)生進(jìn)行快速檢測，在半小時(shí)內(nèi)可以完成取樣與快速檢測。
CN200610034385.9公開了一種利用ATP生物發(fā)光法進(jìn)行微生物數(shù)量快速檢測的方法及檢測試劑盒，快速檢測試劑盒包括熒光素酶及其保護(hù)劑、D-熒光素、標(biāo)準(zhǔn)ATP、發(fā)光檢測緩沖液、非細(xì)胞ATP去除劑、微生物細(xì)胞ATP抽提劑等試劑。應(yīng)用該檢測試劑盒進(jìn)行微生物數(shù)量快速測定的標(biāo)準(zhǔn)方法是通過在選定的生物發(fā)光儀和選定的系統(tǒng)中做ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線，取對(duì)數(shù)后得到線性回歸方程，將經(jīng)過非目的ATP去除和微生物ATP抽提的樣品液，在同樣的儀器和系統(tǒng)中用同一批酶進(jìn)行ATP生物發(fā)光檢測，同時(shí)做空白對(duì)照，得到樣品和空白的CPM或RLU值，去除空白后的凈相對(duì)發(fā)光值取對(duì)數(shù)后，通過建立的回歸方程得到樣品的ATP濃度，根據(jù)細(xì)菌、酵母、霉菌和單細(xì)胞微藻等微生物的ATP含量可換算成細(xì)菌、酵母、霉菌孢子或單細(xì)胞微藻的細(xì)胞數(shù)，或只計(jì)相當(dāng)于細(xì)菌數(shù)量。
[1] CN201110459845.3一種高純度D-熒光素的制備和純化方法
[2] CN201410013473.5一種檢測飲用水中衛(wèi)生質(zhì)量和GMP工廠表面衛(wèi)生的ATP生物發(fā)光試劑、方法及試劑盒
[3] CN200610034385.9生物發(fā)光微生物數(shù)量抗干擾快速檢測試劑盒