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聚乙二醇化學(xué)修飾是將聚乙二醇高分子鏈化學(xué)偶聯(lián)到蛋白質(zhì)分子上，通過增大藥物分子體積以有效延長其體內(nèi)半衰期，同時遮蔽其免疫位點以顯著降低免疫原性，是國際上公認(rèn)的最為有效的長效蛋白質(zhì)制劑化技術(shù)之一。
怎樣把來自動物、植物和微生物的蛋白質(zhì)
20世紀(jì)70年代,美國羅杰斯(Rutgers)大學(xué)的圖書館,經(jīng)常可以見到生化教授FrankF.Davis的身影。那時還沒有計算機,他不得不在一排排書架中搜索。幸運的是已經(jīng)有了復(fù)印機,他充分利用這一條件,復(fù)制了大量的文獻(xiàn)。當(dāng)時,Davis教授正在準(zhǔn)備申請美國國家科學(xué)基金會的基金,但卻需要找到一個創(chuàng)新的課題。他苦苦思考和調(diào)研的課題是怎樣把來自動物、植物和微生物的蛋白質(zhì)做成適合于人體應(yīng)用的藥物。當(dāng)時并沒有DNA重組技術(shù),動物、植物和微生物成了蛋白質(zhì)藥物的主要來源,但是直接使用這些蛋白質(zhì)卻產(chǎn)生了人體的免疫反應(yīng)。Davis教授認(rèn)為,解決這一難題的途徑是將一個親水的大分子連接到蛋白質(zhì)分子上,利用親水性大分子的屏蔽作用,避免或減少外源蛋白質(zhì)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。
什么樣的大分子能夠滿足這一條件？Davis教授通過大量的文獻(xiàn)調(diào)研,把注意力聚焦在多糖類生物大分子上。一些多糖分子不僅水溶性好,而且生物親和性好,不易引起免疫反應(yīng)。但是,多糖分子大都結(jié)構(gòu)復(fù)雜,反應(yīng)位點太多,很難做到反應(yīng)產(chǎn)物的均一、可控,而且文獻(xiàn)上已經(jīng)有前人進(jìn)行了這方面的研究,再去研究并不具備新穎性和創(chuàng)新性,而且前人研究的結(jié)果也沒有解決根本的問題。
一天,他正在翻閱一本醫(yī)療期刊,忽然發(fā)現(xiàn)一篇將聚乙二醇和聚丙二醇嵌段共聚物溶液輸入人體血液的論文,其目的是在器官手術(shù)中避免脂肪栓塞。這篇論文很有意思,因為聚乙二醇和聚丙二醇在人們的印象中是化工產(chǎn)品,和藥物治療幾乎沒有什么關(guān)系。但現(xiàn)在醫(yī)生把它用于輸液,并且取得了初步的成功,說明這種化合物的生物安全性。于是，Davis教授立即把著眼點放在聚乙二醇這一親水性化合物上,開始進(jìn)行新的調(diào)研。隨著調(diào)研的深入,他對聚乙二醇分子越來越感興趣。
其中n表示乙氧基單元的數(shù)量。PEG不僅溶解于水,而且還溶解于一部分有機溶劑,而當(dāng)加入另一些有機溶劑時，又能從原來的溶液中沉淀出來。
和多糖不同,PEG只有末端的羥基可以活化并與蛋白質(zhì)反應(yīng),可以避免反應(yīng)的復(fù)雜性和產(chǎn)物復(fù)雜性。但PEG也有兩個羥基,如果和蛋白質(zhì)反應(yīng),也可能形成不同交聯(lián)程度的“PEG–蛋白質(zhì)–PEG–蛋白質(zhì)”的偶聯(lián)物,甚至可以出現(xiàn)沉淀。是否可以找到一種只有一個末端羥基的聚乙二醇？Davis教授又進(jìn)行了調(diào)研。他翻閱了大量的文獻(xiàn),沒有結(jié)果;他又查找化工廠的產(chǎn)品目錄,終于使他眼睛一亮:在一個工廠的產(chǎn)品目錄上有單甲氧基聚乙二醇(mPEG)。
對這個羥基進(jìn)行活化引入活化基團(tuán)并與蛋白質(zhì)反應(yīng),就只能在羥基末端形成PEG-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物,而不會形成交聯(lián)物。教授迅速和該廠家聯(lián)系,獲得了單甲氧基聚乙二醇。他從圖書館興沖沖地趕回實驗室,帶領(lǐng)他的學(xué)生開展了實驗研究。
20世紀(jì)70年代,是Davis教授課題組迅速崛起的時期。他們獲得了美國國家科學(xué)基金會(NSF)的資助。實驗取得了非常理想的結(jié)果,證明經(jīng)過PEG修飾以后,牛血清白蛋白和牛肝過氧化氫酶在動物體內(nèi)的免疫原性大大降低,而且延長了其在體內(nèi)的半衰期。隨后,更多的蛋白質(zhì)被他們用于PEG修飾,全都顯示了免疫原性下降、體內(nèi)半衰期增加的結(jié)果。他們在國際期刊J.BiologicalChem.上連續(xù)發(fā)表的學(xué)術(shù)論文,引起了學(xué)術(shù)界的重視。
1977年,Davis教授申請了美國發(fā)明專利,內(nèi)容為聚乙二醇或聚丙二醇修飾蛋白質(zhì)和多肽,所用的聚乙二醇或聚丙二醇的分子量范圍為500~20000,修飾產(chǎn)物在注射到動物體內(nèi)后沒有免疫原性。
1983年,Davis教授的博士畢業(yè)生Abuchowski找到了投資方,建立了國際上第一個把聚乙二醇修飾技術(shù)作為主營的生物技術(shù)公司Enzon公司。經(jīng)過一段坎坷的產(chǎn)業(yè)化道路，Enzon公司已經(jīng)成為國際著名的聚乙二醇修飾技術(shù)公司,已有十幾個藥物先后上市或處于臨床階段,總資產(chǎn)達(dá)到六億美元。
對蛋白質(zhì)進(jìn)行化學(xué)修飾的歷史已經(jīng)很長了。從研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)開始,生物化學(xué)家就采用各種化學(xué)方法對蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)如巰基、氨基、咪唑基、胍基、吲哚基進(jìn)行修飾,連接各種化學(xué)基團(tuán)考察蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的變化。因此,當(dāng)Davis教授PEG修飾蛋白質(zhì)的研究內(nèi)容發(fā)表后,并沒有在生物化學(xué)界引起多大的反響。而且當(dāng)對酶進(jìn)行修飾以后,測得的催化活性都下降,甚至很大。從這點出發(fā),有人對PEG修飾持否定的態(tài)度。盡管修飾可以降低蛋白質(zhì)的免疫原性,但生物活性的大幅度下降使得研究者常常放棄了進(jìn)一步的探索。然而,當(dāng)人們將修飾后的蛋白質(zhì)輸入動物,測量其體內(nèi)生物活性時,卻發(fā)現(xiàn)體內(nèi)的生物活性出乎意外地高,而且持續(xù)很長時間。這個發(fā)現(xiàn)使生物技術(shù)公司振奮了,因為他們可以借助這項技術(shù)發(fā)展長效的基因工程蛋白質(zhì)藥物。體外活性低,體內(nèi)活性高,成為PEG修飾蛋白質(zhì)的普遍現(xiàn)象,也是很多人之前沒有想到的。
通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),體內(nèi)活性的提升與PEG的分子量相關(guān):分子量增加通常能夠增加體內(nèi)的藥物半衰期(或半壽期),由此促進(jìn)了聚乙二醇生產(chǎn)企業(yè)去合成更高分子量的mPEG,從1萬增加到2萬、3萬甚至4萬。分枝化的PEG也被合成出來,并表現(xiàn)出比相同分子量的直線型PEG更好的延長體內(nèi)半衰期的作用。到目前為止,上市的聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)藥物都比原藥的半衰期提高幾倍以上,使用藥由原來的每天1針改為每周1針,極大地方便了患者,同時也提高了藥效。例如聚乙二醇修飾干擾素用于治療丙肝,其效果就優(yōu)于未修飾的干擾素。因此聚乙二醇修飾從原來的克服免疫原性的初衷,已經(jīng)發(fā)展為延長藥效、提高治療效果的主要手段。
PEG修飾藥物是否安全？經(jīng)常有人問這樣的問題。雖然這項技術(shù)已經(jīng)有30多年的歷史,藥物上市也已20多年,但像任何藥物一樣,從嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)的角度出發(fā)都不能回答說“沒問題”。一種藥物的副作用,特別是隱匿的、長期使用的副作用,常常需要經(jīng)過許多年后才知道。目前可以說的是,現(xiàn)在還沒有關(guān)于PEG修飾藥物出現(xiàn)重大事故的報道,但人們,特別是醫(yī)藥領(lǐng)域的專家們,都在關(guān)注、研究這些藥物可能出現(xiàn)的副作用。
聚乙二醇(PEG)作為醫(yī)用輔料有更長的歷史。早期美國FDA批準(zhǔn)的人血丙種球蛋白凍干粉制劑中就有PEG作為配方之一。不過這里添加的PEG是雙端為羥基的聚乙二醇,也就是常規(guī)的PEG。關(guān)于常規(guī)的PEG,20世紀(jì)40年代就有人做過動物安全性試驗(Smythetal.,1947),并對其代謝進(jìn)行了探討(Schafferetal.,1950)。試驗表明,分子量較小,例如只有幾百的PEG,有一定的腎毒性;當(dāng)分子量大于1000以后,毒性不夠明顯，例如分子量1450、3350、6000的PEG對兔子靜脈注射給藥,總劑量高達(dá)10g/kg,沒有發(fā)現(xiàn)動物有毒性反應(yīng)。關(guān)于代謝的試驗表明,腎排除是低分子量PEG從體內(nèi)被清除的主要方式,隨著分子量增加,糞便排除亦是從體內(nèi)清除的一種方式。
由于單甲氧基聚乙二醇(mPEG)和PEG極為相像,僅僅是末端一個羥基被替換,因此人們最初從早年P(guān)EG動物試驗數(shù)據(jù)推論mPEG也具有生物安全性。也有文章表明分子量4萬mPEG修飾的干擾素是通過肝臟代謝(Modietal.,2000)經(jīng)糞便排出體外的。但是近年來已有研究發(fā)現(xiàn),mPEG修飾的蛋白質(zhì)藥物會引起機體產(chǎn)生對PEG的抗體,從而加速了藥物的清除。這種抗體的產(chǎn)生可能與其末端的單甲氧基有關(guān)(Armstrongetal.,2007;Shermanetal.,2012)。到目前為止,PEG抗體的發(fā)現(xiàn)還僅限于所報道的PEG修飾蛋白質(zhì)藥物如尿酸氧化酶,在某種程度上影響了藥效,但是否會產(chǎn)生對人體的負(fù)面影響則需要進(jìn)一步的研究。
關(guān)于其藥物副作用或潛在問題的研究,標(biāo)志著PEG修飾藥物技術(shù)及其應(yīng)用正在走向穩(wěn)定和成熟。如今,幾乎所有的生物制藥公司都有人在研究PEG修飾技術(shù):從PEG修飾延伸到其他修飾,如白蛋白修飾、脂肪酸修飾、多糖修飾等。