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用于測(cè)定酸性磷酸酶的最常用試劑是二磷酸酚酞或其四鈉鹽，百里酚酞單磷酸二鈉和萘胺單磷酸二鈉，這些物質(zhì)都是用于確定pH值的經(jīng)典磷酸鹽衍生物，通常以鈉鹽的形式使用。在這些試劑中，二磷酸酚酞或其四鈉鹽更為有效，易于觀察，與其他試劑相比，該試劑的成本低，在介質(zhì)中釋放的酚酞的毒性低。
在50g的燒杯中，稱重8.0g的酚酞，轉(zhuǎn)移至浸入碎冰浴和粗鹽中的三管狀氣球中。然后加入12.5ml二氯甲烷和6.3ml三氯氧化磷，強(qiáng)烈攪拌，獲得均勻懸浮液；將含有6.3ml三乙胺的恒壓加料漏斗與三管燒瓶相連，使反應(yīng)溫度不超過(guò)4°C，在最高4°C的攪拌下保持6小時(shí)，添加少量的10％NaOH溶液來(lái)評(píng)估反應(yīng)進(jìn)程，該測(cè)試顯示為粉紅色，就可以將反應(yīng)保持在室溫下，如果觀察到陰性結(jié)果，即相對(duì)于10％NaOH溶液為無(wú)色，則應(yīng)重復(fù)該測(cè)試。
之后蒸發(fā)除去二氯甲烷，然后在約4°C下不斷攪拌下加入100ml冷蒸餾水，釋放所有HCl蒸氣后，觀察到形成類似于琥珀色的淡黃色沉淀物質(zhì)，在攪拌下添加40％NaOH溶液，直到所有沉淀物重新溶解為止。用pH1.00的無(wú)機(jī)酸酸化鄰苯二甲酸二磷酸酯的水溶液，使苯甲酸鄰苯二甲酸二磷酸酯沉淀，然后從上清液中分離出該物質(zhì)，并在250mL燒杯中，將酸性雙磷酸苯酞的全部物質(zhì)溶于最少量的新鮮蒸餾的VetecPA級(jí)甲醇中，加入幾滴VetecPA級(jí)甲酰胺以增加溶解度，在攪拌下加入1.0mol.L-1乙醇鈉溶液，直到所有沉淀完成，通過(guò)過(guò)濾分離苯基酞菁雙磷酸四鈉的沉淀，然后用無(wú)水乙醚反復(fù)洗滌鄰苯二甲酸酯雙磷酸四鈉，重復(fù)該步驟直到固體幾乎干燥。將鄰苯二甲酸二苯酯雙磷酸四鈉溶解在最少量的甲醇/甲酰胺（5：1）中，然后緩慢加入乙醇，使純化的二磷酸酚酞重新沉淀，過(guò)濾分離后，將二磷酸酚酞四鈉保持在真空干燥器中。
[1] WO2015035487 METHOD AND KIT FOR SYNTHESIZING PHENOLPHTHALEIN DIPHOSPHATE TETRASODIUM