20554-84-1/小白菊內(nèi)酯

【背景及概況】^[1][2][3]

小白菊內(nèi)酯是一種倍半萜烯內(nèi)酯類天然產(chǎn)物，分離自艾菊、觀光木等藥用植物，這些植物廣泛應(yīng)用于發(fā)熱、驅(qū)蟲和抗炎等。近年來的研究證實小白菊內(nèi)酯具有多種重要的藥理活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗動脈粥樣硬化等，小白菊內(nèi)酯傳統(tǒng)上主要用來治療偏頭痛、發(fā)熱和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。近年來研究發(fā)現(xiàn)小自菊內(nèi)酯在多種腫瘤中發(fā)揮抗癌作用，如乳腺癌、膽管癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、黑色素瘤和神經(jīng)元 等，并成為研究的一個重要熱點，作用機制主要為抑制核轉(zhuǎn)錄因子kappa B、組蛋白去乙?；负桶准毎樗?12等。但是小白菊內(nèi)酯的水溶性較差，這也限制了它的臨床研究和應(yīng)用。為了提高小白菊內(nèi)酯的水溶性和生物活性，人們對其結(jié)構(gòu)進行了大量的修飾與改造工作，發(fā)現(xiàn)了一些具有優(yōu)異生物活性的小白菊內(nèi)酯衍生物。前期研究顯示，小白菊內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中a -亞甲基-7-丁內(nèi)酯的Micheal加成產(chǎn)物能夠增加分子的水溶性，并保持或提高生物活性。二甲胺衍生物L(fēng)C-1是其中的一個成功實例，其具有顯著的抗腫瘤和良好的理化參數(shù)，目前已進人臨床研究。

【結(jié)構(gòu)】^[1]

小白菊內(nèi)酯分子式C₁₅H₂₀O₃，分子量248.32，CAS號20554-84-1，結(jié)構(gòu)式如下：

【生物活性及應(yīng)用】^[1][3][4]

倍半萜內(nèi)酯類化合物小白菊內(nèi)酯是從小白菊中提取的化合物，最初被用來治療皮膚感染、風(fēng)濕病以及偏頭痛。近期研究表明，小白菊內(nèi)酯可抑制前列腺癌、乳腺癌、胃癌、白血病癌、腎癌、肺癌、結(jié)腸腺癌、成神經(jīng)管細胞瘤等癌細胞的生長，在動物模型上小白菊內(nèi)酯還能治療紫外線引起的皮膚癌。對其作用機理研究發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯能抑制轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活，其活性可能主要來源于p65/NF-κB亞基的Cys38上的巰基與含笑內(nèi)酯發(fā)生了 Michael加成反應(yīng)，由于NF-κB是調(diào)控腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、藥物抗性的重要基因，抑制NF-κB的激活有可能提高腫瘤對于抑瘤劑所引起的細胞凋亡的敏感性。最近，紐約羅切斯特大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Jordan，C.T.博士及其同事發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯能夠在基本不損傷正常干細胞的情況下，針對性地消滅引發(fā)急性和慢性骨髓性白血病的干細胞，從而有可能根本上遏制白血病復(fù)發(fā)，小白菊內(nèi)酯這一獨特的作用機制，已引起人們的廣泛關(guān)注。其具體作用可分為以下幾點：

1. 抑制先天免疫

小白菊內(nèi)酯能夠抑制先天免疫系統(tǒng)一組低聚物分子的炎癥蛋白質(zhì)集合體，這類蛋白質(zhì)在對危險信號起反應(yīng)的固有免疫細胞胞漿中形成，主要招募和激活caspase-1，使無活性的前IL-1p3和前IL-l8轉(zhuǎn)換為有活性的IL-1B3和IL-18。其中NALP3尤其重要，不適當(dāng)?shù)腘ALP3激活與人類許多疾病的發(fā)病有關(guān)，包括痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、矽肺、神經(jīng)退行性變等。細菌、病毒、純化的微生物制品、小分子免疫激活劑、死亡細胞的成分、結(jié)晶體或聚集物等都可以激活NALP3。小白菊內(nèi)酯能夠強有力的抑制多種炎癥蛋白，可直接抑制蛋白水解酶caspase-1的活性和NLRP3的三磷酸腺苷酶活性。研究證實，小白菊內(nèi)酯通過烷化p20中關(guān)鍵半胱氨酸殘基而抑制caspase-1，質(zhì)譜法鑒定發(fā)現(xiàn)一個p20半胱氨酸殘基的caspase-1上的半胱氨酸285活性中心被小白菊內(nèi)酯修飾，類似推測，小白菊內(nèi)酯對NL-RP3依賴的三磷酸腺苷酶活性的抑制效應(yīng)也可能是由于烷化作用所導(dǎo)致，并不依賴于NF-KB途徑 。在活體外，小白菊內(nèi)酯能夠抑制IgE抗原誘導(dǎo)的肥大細胞脫顆粒，并獨立于NF-KB途徑，而沒有觀察到小白菊內(nèi)酯對FcsR1介導(dǎo)的早期信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子多種蛋白酪氨酸磷酸化有影響，包括p38，JNK1/2，ERK1/2，和cPKCs，小白菊內(nèi)酯直接干擾了肥大細胞的微導(dǎo)管的形成；在活體內(nèi)，小白菊內(nèi)酯能抑制IgE介導(dǎo)的被動皮膚過敏反應(yīng) ?；谛“拙諆?nèi)酯干擾肥大細胞脫顆粒的生物特性，可能被用于研制有效的抗過敏藥物。

2. 抗炎

小白菊內(nèi)酯通過細胞內(nèi)機制抑制IkB蛋白磷酸化和NF-KB的激活起到抗炎作用，而小白菊內(nèi)酯作為強有力的NF-KB抑制劑，其抑制NF-KB中IKK復(fù)合體的精確靶點目前文獻報道尚不一致。在應(yīng)用與小白菊內(nèi)酯有親和作用的試驗研究中，鑒定IKKJ3為其作用靶點，而另有研究提示小白菊內(nèi)酯并不直接作用于IKKB或IKKc，而是NEMO 。用不同濃度的小白菊內(nèi)酯直接加入細胞核提取物中并在室溫下孵化1h后用P-寡核苷酸探針檢測，顯示在體外小白菊內(nèi)酯不改變已激活的NF-KB結(jié)合DNA的能力，表明小白菊內(nèi)酯只是阻止了NF-KB的活化，而不是阻止已激活的NF-KB結(jié)合DNA的能力。激活NF-KB是血管損傷的一個重要步驟，對這一過程的藥理學(xué)調(diào)節(jié)作用成為開展動脈粥樣硬化新療法的主要目標(biāo)，在脂多糖(LPS)刺激的血管平滑肌細胞和單核細胞，非毒性劑量的小白菊內(nèi)酯能夠抑制IkBa的降解，NF-KB的激活以及MCP-1的表達，而不抑制AP-1和MAP激酶 ；在apoE小鼠，小白菊內(nèi)酯能夠通過NF—KB抑制延緩動脈粥樣硬化損傷，減少損傷區(qū)域，改變斑塊成分，而不影響細胞凋亡和氧化應(yīng)激過程 。在心肌缺血再灌注損傷，小白菊內(nèi)酯被證實通過選擇性抑制IKK的激活和IkBa降解起到保護作用 。

3. 誘導(dǎo)凋亡

常染色體隱性多囊腎病是由于編碼跨膜受體樣蛋白fi-brocystin/polyductin的PKHD1基因突變所致，缺乏FC1的腎臟細胞將會出現(xiàn)ERKI/2激酶活性下降，致凋亡蛋白p53上調(diào)和NF-KB激活，從而凋亡，小白菊內(nèi)酯阻斷IKK依賴的NF-KB的激活，減少缺乏FC1的腎臟細胞凋亡和致凋亡蛋白p53水平，為常染色體隱性多囊腎病的治療開辟一個新的研究領(lǐng)域 。在人胰腺癌細胞株BxPC-3，經(jīng)小白菊內(nèi)酯處理后出現(xiàn)Bcl-2和前caspase-3蛋白下調(diào)及Bax和caspase-9蛋白上調(diào)，線粒體細胞色素C釋放至胞漿，和轉(zhuǎn)接分子Apaf-1結(jié)合，形成凋亡小體并激活caspase-9和caspase 3ll。在肝細胞瘤細胞(sH-J1)，小白菊內(nèi)酯并不抑制Bc1-2或Bcl-X (L)蛋白，氧化應(yīng)激與小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)，SH-J1對小白菊內(nèi)酯敏感主要是由于多功能解毒酶谷胱甘肽s一轉(zhuǎn)移酶的低水平表達。另有研究表明，在小白菊內(nèi)酯能夠通過抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3激活，誘導(dǎo)死亡受體的表達使肝細胞癌細胞對TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體致敏，激活caspase-9和caspase-3，從而導(dǎo)致凋亡 。

4. 氧化應(yīng)激

1）抗氧化應(yīng)激血液透析患者有諸多生化、免疫和炎癥改變，并增加心血管疾病的風(fēng)險。這些紊亂可能來自患者尿毒癥綜合征本身，也可能是由于血液透析本身誘導(dǎo)的應(yīng)激所致。應(yīng)用脂多糖刺激外周血單核細胞釋放模擬血液透析誘導(dǎo)的應(yīng)激，小白菊內(nèi)酯能夠抑制TNFot、IL-1B、IL-6的分泌以及cox-2的激活，從而保護白細胞免受血液透析誘導(dǎo)的應(yīng)激損傷，無明顯毒副作用 。如果小白菊內(nèi)酯的衍生物能夠加入透析液中，透析時通過透析膜進入血液，保護白細胞免受透析誘導(dǎo)的損傷，將會出現(xiàn)保護血液透析氧化損傷的理想化合物。

2）增強氧化應(yīng)激反應(yīng) 研究發(fā)現(xiàn)，非毒性劑量（≤5~mol/L）小白菊內(nèi)酯可顯著地減少Jurkat T細胞的激活誘導(dǎo)性細胞死亡(AICD)，小白菊內(nèi)酯通過阻斷NF-KB與CD95L促進劑的結(jié)合而抑制CD95(APO-1/Fas)L的表達，保護CD95介導(dǎo)的活性T細胞的AICD，小白菊內(nèi)酯這一作用過程對NF-KB的抑制具有相對的高度特異性，而不抑制JNK、p38和AP-1，而高濃度小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)Jurkat T細胞的凋亡卻獨立于NF-KB途徑，主要是抑制細胞周期G/M停滯，不能保護T細胞的AICD 。低濃度的小白菊內(nèi)酯能夠通過阻止TCR信號途徑減少氧化應(yīng)激，在高濃度時卻通過自身的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)活性氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激介導(dǎo)的Jurkat T細胞凋亡，增強了氧化應(yīng)激，表明小白菊內(nèi)酯對氧化應(yīng)激有雙向調(diào)控作用，這一點對小白菊內(nèi)酯的臨床應(yīng)用將會非常重要。小白菊內(nèi)酯能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的前B細胞白血病細胞的凋亡 、通過增強氧化應(yīng)激誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡 等支持其通過氧化應(yīng)激具有抗腫瘤作用。

5. 抗腫瘤

在培養(yǎng)的JB6表皮細胞，損傷的AP-1、JNK、p38信號肽導(dǎo)致JB6細胞對中波紫外線誘導(dǎo)的凋亡致敏，通過致敏細胞的凋亡移除損傷的細胞意味著能夠預(yù)防癌癥的發(fā)生過程，而非毒性劑量的小白菊內(nèi)酯明顯抑制中波紫外線誘導(dǎo)的AP-1的DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄活性，小白菊內(nèi)酯和UVB對致敏細胞的凋亡有協(xié)同作用，并且小白菊內(nèi)酯通過對AP-1和MAP激酶的抑制起到化學(xué)防癌的作用。給予小白菊內(nèi)酯預(yù)處理HL-60細胞，則1，25-二羥基維生素D3呈時間和劑量依賴的方式增強HL-60細胞分化為單核細胞，小白菊內(nèi)酯通過抑制NF-KB的結(jié)合活性顯著增加HL-60細胞分化的程度，而不具有抑制NF-KB的倍半萜內(nèi)酯化合物蛔蒿素不能增加HL-60細胞的分化；轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯增強維生素D受體反應(yīng)元件依賴的促進劑的活性，通過抑制NF-KB信號通路的激活劑TNF-0恢復(fù)，25-二羥基維生素D3誘導(dǎo)的VDRE依賴的促進劑的活性 。小白菊內(nèi)酯和其類似物L(fēng)C-1能夠單獨或共同對造血細胞起抗腫瘤作用，包括有急性髓性白血病 、前B細胞型急淋和慢性淋巴細胞白細胞。在不同的急性髓性白血病細胞株，小白菊內(nèi)酯能夠抑制組蛋白脫乙?；敢种苿┙閷?dǎo)的NF．KB激活和促進SAPK/eJNK激活和凋亡 。

6. 抗血小板作用

小白菊內(nèi)酯在一些類型的癌細胞可以通過抑制NF-KB和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激來誘導(dǎo)凋亡、分化和增殖。有趣的是，這兩種途徑都與巨核細胞突變和血栓形成的最后階段有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，小白菊內(nèi)酯通過抑制巨核細胞的NF-KB途徑增強血小板產(chǎn)物可獨立于其誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，小白菊內(nèi)酯在增強功能性血小板產(chǎn)物的同時減輕了不必要的血小激活，其他研究也提示小白菊內(nèi)酯能夠直接非依賴性地增強血小板產(chǎn)物 。在抗血小板藥物方面，也需要一種藥物在抗血小板的同時能夠減少不必要的血小板激活，以此減輕炎癥反應(yīng)。小白菊內(nèi)酯介導(dǎo)的其他的抗血小板機制包括花生四烯酸代謝的變化和與蛋白激酶C 的相互作用。

7. 抗病毒

小白菊內(nèi)酯具有抗病毒活性，作為一種前驅(qū)化合物，小白菊內(nèi)酯在半數(shù)有效濃度時能夠在亞基因組RNA復(fù)制子測定系統(tǒng)抗丙型肝炎病毒復(fù)制，一個成功的抗病毒治療需要雞尾酒添加療法，在丙肝病毒復(fù)制子系統(tǒng)，聯(lián)合干擾素一后小白菊內(nèi)酯表現(xiàn)出添加效應(yīng)。

8. 抑制原蟲的生長

小白菊內(nèi)酯能夠抑制利什曼原蟲和克氏錐蟲的生長，并且能夠使上鞭毛體的形態(tài)活動度發(fā)生改變。而殺錐蟲藥對氨甲酰甲胺苯胂酸鈉聯(lián)合1 g/mL小白菊內(nèi)酯可以誘導(dǎo)克氏錐蟲蟲體圓繞和縮短，并且使?jié){膜的完整性喪失，漿膜形狀和結(jié)構(gòu)的改變可能是由于藥物作用漿膜下的微導(dǎo)管所致，進一步表明小白菊內(nèi)酯和抗原蟲藥物有協(xié)同作用。

【制備】^[4]

一種從廣玉蘭根皮中分離提取小白菊內(nèi)酯的方法，該方法包括以下步驟：

1）取廣玉蘭干燥根皮，粉碎成粉；

2）取粉碎的粗粉，用5～20倍重量的適當(dāng)?shù)奶崛∪軇┰谑覝亟荻啻危看?6-108小時。

3）過濾，合并濾液，減壓回收溶劑得提取浸膏；

4）提取浸膏用質(zhì)量濃度10％-30％的乙醇或甲醇溶液溶解，再用適當(dāng)?shù)挠袡C溶劑萃取至顏色變淡，合并有機溶劑，減壓回收有機溶劑，干燥得總倍半萜內(nèi)酯類化合物；

5）取上述總倍半萜內(nèi)酯類化合物上硅膠色譜柱，以混合有機溶劑梯度淋洗，跟蹤檢測，收集含小白菊內(nèi)酯的流份，合并減壓回收混合有機溶劑，干燥得小白菊內(nèi)酯。上述方法還可以包含小白菊內(nèi)酯的結(jié)晶過程，結(jié)晶過程如下：

6）小白菊內(nèi)酯在適當(dāng)?shù)娜軇┲械脽o色結(jié)晶狀化合物小白菊內(nèi)酯。

【參考文獻】

[1] 李申恒, 李小云, 周偉東, 等. 小白菊內(nèi)酯及其衍生物藥理作用研究進展[J]. 中成藥, 2012, 34(10): 1990-1994.

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[3] 張磊, 陳凡, 王京. 小白菊內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)修飾, 生物活性及構(gòu)效關(guān)系研究進展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2017, 29(9): 1617-1620.

[4] 張泉；龍壽江；陳悅；翟佳黛；張福武；范洪霞；馬維維.小白菊內(nèi)酯的制備方法. CN201010168478.7，申請日2010-05-11