19132-06-0/(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇的兩種制備方法報(bào)道

背景及概述^[1]

(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇是一種光學(xué)純的2，3-丁二醇(2，3-bd)。2，3-丁二醇是一種重要的鄰二醇，具有3個(gè)立體異構(gòu)體：meso-2，3-丁二醇、(2R，3R)-2，3-丁二醇和(2S，3S)-2，3-丁二醇。作為一種重要的平臺(tái)化學(xué)物質(zhì)，2，3-bd可用于生產(chǎn)有價(jià)值的衍生物，如甲基乙基酮和1，3-丁二烯。光學(xué)活性異構(gòu)體可以作為防凍劑。光學(xué)純2，3-bd也可作為包含兩個(gè)鄰位立體中心的手性化合物的不對(duì)稱(chēng)合成的良好構(gòu)建塊。

制備^[1-2]

報(bào)道一、

步驟1、一種含有酮還原酶的溶液的制備方法，其包括以下步驟：

(1)將酮還原酶的編碼基因插入到pET28a(+)載體的Nco I和EcoR I酶切位點(diǎn)之間，得到重組載體；

(2)將上述重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，得到重組菌株。

(3)將上述重組菌株接種至含有氯霉素的LB固體培養(yǎng)基中，并置于37℃條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)20h，得到菌落；用接種環(huán)挑取單菌落接種于含50mL的LB培養(yǎng)基(加有氯霉素)的250mL錐形瓶中，蓋上封瓶膜，用橡皮筋扎牢；然后，將錐形瓶放置于振蕩培養(yǎng)箱中，置于30℃、250rpm條件下培養(yǎng)過(guò)夜20h，得到培養(yǎng)液。

(4)取上述培養(yǎng)液接種于含有TB培養(yǎng)基(加有氯霉素)的錐形瓶中，蓋上封瓶膜，用橡皮筋扎牢，并將錐形瓶放置于振蕩培養(yǎng)箱中(30℃、250rpm)進(jìn)行培養(yǎng)至OD600為0.7時(shí)，添加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)酮還原酶表達(dá)，并置于30℃、250rpm條件下繼續(xù)過(guò)夜培養(yǎng)16h，即可得到所述含有酮還原酶的溶液。其中，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷的終濃度為1mmol/L。

步驟2、一種(2S，3S)-2，3-丁二醇的制備方法，其包括以下步驟：

(1)取6.06g上述步驟1得到的含有酮還原酶的溶液與20mL濃度為0.01mol/L的磷酸緩沖鹽溶液置于裝有磁子的干凈的250mL單口燒瓶中，并將單口燒瓶置于20℃的水浴中，以400rpm的速度對(duì)單口燒瓶?jī)?nèi)的溶液進(jìn)行攪拌混合，得到混合液。

(2)在攪拌過(guò)程中，保持水浴溫度不變，并往上述混合液中依次添加0.202g的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、100mL的異丙醇以及20.2g的2，3-丁二酮進(jìn)行密閉反應(yīng)，得到反應(yīng)液。

(3)對(duì)上述反應(yīng)液進(jìn)行減壓抽濾，得到淡黃色的濾液，然后將濾液置于45℃、0.08MPa的條件下進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理，待幾乎無(wú)液體流出，得到提取液。

(4)將上述提取液置于50℃的水浴中，并用一根精餾柱和冷凝管無(wú)液體升溫至70℃進(jìn)行精餾分離，即可得到(2S,3S)-(+)-2,3-丁二醇。

報(bào)道二、

以重組E.coli全細(xì)胞為生物催化劑，以 雙乙酰(DA)和葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)手性純2S，3S?BD的具體方法是：

(1)平板培養(yǎng)：將重組E.coli菌株劃線(xiàn)到含有質(zhì)量體積比為1.5～1.8％瓊脂的并含有 100μgmL?1氨芐青霉素的LB平板上，37±1℃培養(yǎng)12±1小時(shí)；

(2)一級(jí)種子：在無(wú)菌的條件下，用無(wú)菌的牙簽挑取步驟(1)平板上的一個(gè)單菌落， 然后接種到5mL的含有100μg mL?1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37±1℃搖床震 蕩培養(yǎng)12±1小時(shí)；

(3)二級(jí)種子：在無(wú)菌條件下，取步驟(2)所培養(yǎng)的菌液以體積比1～3％的接種量， 接種到30～500mL含有100μg mL?1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37±1℃搖床震 蕩培養(yǎng)12±1小時(shí)；

(4)發(fā)酵罐培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，取步驟(3)所得的菌液以體積比為6～10％的接種 量接種到2～10L的含有100μg mL?1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37±1℃培養(yǎng)5～ 20小時(shí)，然后再加入終濃度為1mM的IPTG，10～37℃誘導(dǎo)5～24小時(shí)，停止發(fā)酵；

其中，上述步驟(1)～(4)中所述的LB培養(yǎng)基配方為：1L蒸餾水中含：10g蛋白 胨，5g酵母粉，10gNaCl，121℃條件下滅菌15分鐘。

(5)收集菌體：將步驟(4)培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物8,000±500rpm離心15分鐘；并用 0.85wt％的生理鹽水洗滌菌體2～3遍，然后將細(xì)胞懸起到pH 7、200mM的Tris?HCl緩 沖液中，使細(xì)胞的終濃度為2～10g L?1；將菌體置于4℃的冰箱中保藏，即得到重組E.coli 全細(xì)胞生物催化劑，待用；

(6)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)制備產(chǎn)物：以濃度為2～10g L?1的生物催化劑，在10～42℃、pH 5.0～9.0 條件下，180rpm搖床震蕩，轉(zhuǎn)化初始濃度為5～20g L?1的DA，并加入5～120g L?1的葡 萄糖以補(bǔ)充反應(yīng)所需輔因子的消耗；每隔2小時(shí)取樣，樣品以8,000±500rpm離心10～15 分鐘，去除所加入的生物催化劑，檢測(cè)上清中DA和葡萄糖濃度，根據(jù)DA和葡萄糖濃度 補(bǔ)加DA和葡萄糖，使DA濃度達(dá)到5～20g L?1，葡萄糖濃度達(dá)到5～120g L?1；對(duì)上清進(jìn) 行氣相色譜分析測(cè)定轉(zhuǎn)化液中2S，3S?BD的濃度及光學(xué)純度；當(dāng)2S，3S?BD的濃度不再增加 時(shí)，停止轉(zhuǎn)化。

參考文獻(xiàn)

[1] [中國(guó)發(fā)明] CN202010556922.6 一種(2S,3S)-2,3-丁二醇的制備方法

[2] [中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)] CN201110021066.5 一種生產(chǎn)手性純(2S,3S)-2,3-丁二醇的方法