相關(guān)技術(shù)描述L-天門冬氨酸-α-脫羧酶催化從L-天門冬氨酸中產(chǎn)生β-丙氨酸。Nakano等表明了來自大腸桿菌B株的粗提取物中有此酶活性。Nakano，Y.等，生物化學(xué)雜志；70卷，327-334頁(1971)。Williamson等進(jìn)一步研究了把大腸桿菌中的該酶純化到表觀均一后的酶活性。Williamson，J等，生物化學(xué)雜志，254(16)卷，8074-8082頁(1979年8月)。這些發(fā)明的文獻(xiàn)并不說明除了實(shí)驗(yàn)的好奇外，能產(chǎn)生任何可實(shí)際應(yīng)用的酶量。正如下面更全面討論的那樣，本發(fā)明利用一種組合物，使L-天門冬氨酸-α-脫羧酶的活性為Nakano等和Williamson等文獻(xiàn)中發(fā)表的該酶活性的100～2000倍。

在給Rozzell的美國專利號5,019,509中公開了產(chǎn)生L-丙氨酸和其衍生物的方法和組合物。然而，Rozzell公開了編碼天門冬氨酸-β-脫羧酶的基因以及用于產(chǎn)生L-丙氨酸。在給Houng的美國專利號5,552,317和5,552,318中，公開了用來自小麥胚或解脂假絲酵母(Candidalipolytica)的脂肪酶制備旋光活性氨基酸和其酯類的方法。相比之下，本發(fā)明的方法不是如Houng等方法那樣的常見轉(zhuǎn)變方法，常見的方法是，氨基酸的轉(zhuǎn)變實(shí)際上依靠氨基酸的衍生物進(jìn)行，因而需要額外的化學(xué)步驟。最為常見的方法是，外消旋酯類用酯酶/脂肪酶處理，或N-乙酰氨基酸用酰基酶處理。

已知的其他轉(zhuǎn)變程序是應(yīng)用酰胺酶，作用于消旋的氨基酸酰胺，其中該酶恰特異地針對一種異構(gòu)體。見美國專利號4,880,737。然而，本發(fā)明提供一種更為簡單的方法，因?yàn)椴挥妙~外的化學(xué)修飾以制備底物。

本發(fā)明提供容易的途徑，從豐富的資源D，L-天門冬氨酸中，產(chǎn)生2種廣泛使用的化合物。在藥用中，已有大量的文獻(xiàn)描述D-天門冬氨酸和其衍生物。這些應(yīng)用包括，但不局限于抑制精氨酸基琥珀酸合成酶活性和用作免疫抑制劑。抑制精氨酸基琥珀酸合成酶活性，可用于預(yù)防或治療膿毒癥或細(xì)胞因子誘導(dǎo)的系統(tǒng)性低血壓。D-天門冬氨酸的其它應(yīng)用包括作食物的味覺修飾組合物，和由Pfizer開發(fā)的一種新甜味劑，AlitameTM。另外，β-丙氨酸用于泛酸的合成，而泛酸對輔酶A的合成是必需的。也已知β-丙氨酸用作手性合成子合成α-替代的β氨基酸。β-丙氨酸的衍生物已被用作電鍍業(yè)中的緩沖液。

制備方法

質(zhì)粒pIF309的制備編碼L-天門冬氨酸-1-脫羧酶的panD基因，從大腸桿菌K12染色體中，用下列PCR方法分離

A.染色體DNA制備大腸桿菌W3110菌株從Coli遺傳貯存中心(耶魯大學(xué)，Newhaven，CT)獲得。菌株按照提供者的指示復(fù)蘇，在500ml培養(yǎng)瓶中37℃下，50ml體積的Luria肉湯中搖動(dòng)培養(yǎng)過夜。10ml等份培養(yǎng)物10,000×g離心4分鐘。棄去上清液，沉淀重新懸浮在1ml的含50mMTris/HClpH8.0，10mMEDTA和100μg/mlRNaseA(Sigma)的溶液中。溶液在室溫下溫育10分鐘。加入2ml的含0.4％(w/v)十二烷基硫酸鈉(“SDS”)和100μg/ml蛋白酶K(Sigma)的溶液。37℃下溫育溶液20分鐘。加入pH5.2的乙酸鈉至終濃度為300mM。然后，該溶液用37℃的等體積的苯酚抽提3次，用2.5倍體積的乙醇沉淀。然后用無菌環(huán)移取DNA，DNA重新溶解在400μlpH5.2的300mM乙酸鈉中。然后，DNA用2.5倍體積的乙醇重新沉淀，按前述的方法移取，干燥，溶在500μl的10mMTrispH8.0和1mMEDTA中。終濃度大約為200μg/ml。

B.通過PCR擴(kuò)增panD通過PCR擴(kuò)增大腸桿菌panD基因，用0.2mlMicroAmpTM反應(yīng)管(PerkinElmer，Norwalk，CT)完成，在反應(yīng)管中加入100ng如上述制備的大腸桿菌染色體DNA，dATP、dGTP、dCTP和dTTP(每種10mM)各2μl，10μl含有15mMMgCl、500mMKCl、100mMTrispH8.3的緩沖液和0.01％(w/v)明膠，5UTaqDNA聚合酶(AmpliTaqTM)和5μl10nmol/ml的下列每種寡核苷酸引物溶液，寡核苷酸引物根據(jù)已知的方法，用應(yīng)用生物系統(tǒng)380BDNA合成儀合成。(MB1682)5′CGCGGATCCACTATGATTCGCACGATGCTGCAGGGC3′(MG1683)5′CAGCGTGCATGCTCAAGCAACCTGTACCGGAATCGC3′反應(yīng)在PerkinElmer9600TMPCR熱循環(huán)儀(PerkinElmer)中進(jìn)行。擴(kuò)增反應(yīng)按下列方法進(jìn)行，94℃預(yù)熱3分鐘，接著94℃變性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)。然后反應(yīng)混合液貯存在4℃。

C.panD的克隆擴(kuò)增的panD基因克隆到來源于質(zhì)粒pBR322的質(zhì)粒載體上。該質(zhì)粒命名為pIF309。含有panD基因的片段用限制性酶BamHI和SphI完全消化，連接到相似方式切割的載體單獨(dú)BamHI和SphI位點(diǎn)之間。在HindIII和BamHI之間插入合成的DNA片段，該DNA片段帶有大腸桿菌K12pheA啟動(dòng)子區(qū)的修飾變體。該片段完全在應(yīng)用生物系統(tǒng)380BDNA合成儀上合成，資料來源于與Fotheringham等共有的美國專利5,120,837。上述序列見如下：HindIIIAAGCTTTTTTGTTGACAGCGTGAAAACAGTACGGGTATAATACTAAAGTCACAAGGAGGATCCBamHI質(zhì)粒pIF309在圖1中顯示。限制性消化用由新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司提供的酶進(jìn)行，根據(jù)制造商的具體說明(NEB，Beverly，MA)使用。使用由Takara生物化學(xué)公司(PanveraCorp.，MadisonWI)提供的連接反應(yīng)試劑盒，根據(jù)制造商的具體說明進(jìn)行DNA片段連接。

通過從按如下描述生長的NS3291菌株培養(yǎng)物制備的提取液中，生物學(xué)測定L-天門冬氨酸-1-脫羧酶活性確定panD的表達(dá)。