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10-甲酰葉酸是一種葉酸衍生物。葉酸是一種具有重要營養(yǎng)價值的水溶性B族維生素，是指四氫葉酸及其衍生物這一類物質(zhì)，它由蝶啶、對氨基苯甲酸和谷?；溄M成。作為一碳供體，葉酸參與嘌呤、嘧啶的合成和氨基酸的相互轉(zhuǎn)化。人體缺少葉酸會導致一系列的慢性疾病，例如神經(jīng)管缺陷、先天缺陷、巨紅血球性貧血、心血管疾病和癌癥等。
CN201510527402.1報道了一種快速高靈敏同步定量檢測蔬菜中總?cè)~酸及其衍生物含量的方法，依次包括以下步驟：
1)、提取植物葉片中的葉酸及葉酸衍生物：
利用0.05M磷酸緩沖液煮沸提取植物葉片的葉酸，冷卻并離心后，得上清液，上清液為葉酸提取物(包括葉酸及葉酸衍生物)；
2)、添加兩種葉酸軛合酶
往步驟1)中的葉酸提取物添加老鼠血清軛合酶和雞胰腺軛合酶，加入氬氣后37℃孵育2小時，100℃水浴5分鐘終止酶活，離心后取上清液，上清液為葉酸去軛合提取物；
3)、使用超濾離心管純化植物葉片葉酸去軛合提取物
使用10kDa500μL超濾離心管(Millipore，美國)，活化后，往里加入500μL步驟2)得的葉酸去軛合提取物，12000g4℃離心15分鐘，得到純化后的葉酸純化液(為過柱后所得的溶液)；
4)、超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分離葉酸衍生物質(zhì)譜方法
超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測系統(tǒng)為四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(WatersXevoTQ-S,Waters,美國)常壓電噴霧電離(ESI)正極模式。WatersIntelliStartTechnology通過自動和手動優(yōu)化所有葉酸衍生物的多離子反應監(jiān)測(multiplereactionmonitoring,MRM)。每一種葉酸衍生物使用兩個或三個子離子確定，結果如表1。MassLynx4.1(Waters,美國)軟件用于系統(tǒng)運行、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。表1葉酸及葉酸衍生物的多離子反應檢測和化合物指標
5)、超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分離葉酸衍生物色譜方法
使用WatersACQUITYUPLC系統(tǒng)(Waters，美國)進行葉酸衍生物的色譜分離，運行軟件為TargetLynx4.1(Waters，美國)。柱溫箱維持40℃，自動進樣器維持4℃。色譜柱是ACQUITYUPLCBEH,C18column，規(guī)格為2.1mm×50mm，粒徑1.7μm(Waters，美國)連接一個VanGuard前置柱C18，規(guī)格為5mm×2.1mm，粒徑1.8μm(Waters，美國)。流速0.4mL/min；進樣量2μL，運行時間5分鐘。流動相為洗脫液A(0.1％甲酸溶于水)和洗脫液B(0.1％甲酸溶于乙腈)梯度洗脫，詳見表2。針頭清洗溶劑為乙腈/水混合液(50/50,v/v)；表2UPLC-MS/MS最佳梯度洗脫
6)、植物葉片葉酸衍生物的定量測定。
作為本發(fā)明高效高靈敏同步定量檢測植物葉片總?cè)~酸及其衍生物的方法的改進：步驟1)中的0.05M磷酸緩沖液濃度為每升加入10gL(+)-抗壞血酸和10ml二巰基丙醇的磷酸緩沖液。
作為本發(fā)明高效高靈敏同步定量測量植物葉片總?cè)~酸及其衍生物的方法的進一步改進：所述步驟2)中在每10mL葉酸提取物中加入2mL雞胰腺軛合酶，搖勻后，吸取3mL溶液于50mL離心管中，加入100μL老鼠血清軛合酶，搖勻，充入氬氣，37℃孵育2小時，100℃水浴5分鐘終止酶活。
作為本發(fā)明高效高靈敏同步定量檢測植物葉片總?cè)~酸及其衍生物的方法的進一步改進：所述步驟6)為：根據(jù)步驟4)和步驟5)的條件，對植物葉片葉酸及其衍生物進行定量測定，記錄主峰峰面積，按照外標法以峰面積自動計算得出四氫葉酸、5-甲基-四氫葉酸、5-甲酰-四氫葉酸、5,10-次甲基四氫葉酸、10-甲酰葉酸、10-甲酰-四氫葉酸、葉酸的含量，再根據(jù)四氫葉酸、5-甲基-四氫葉酸、5-甲酰-四氫葉酸、5,10-次甲基四氫葉酸、10-甲酰葉酸、10-甲酰-四氫葉酸、葉酸的濃度和相對分子質(zhì)量計算總?cè)~酸含量。
[1][中國發(fā)明,中國發(fā)明授權]CN201510527402.1快速高靈敏同步定量檢測葉片總?cè)~酸及葉酸衍生物的方法