131-99-7 / 利用新分離的米曲霉AMP脫氨酶生產(chǎn)5′-肌苷酸的研究

5'-腺苷酸脫氨酶（AMP脫氨酶）能催化一磷酸腺苷（AMP）不可逆水解為一磷酸肌苷（IMP）和氨，是食品工業(yè)中的一種重要的酶。本研究篩選出一株新菌，可在32℃下高效產(chǎn)生3191.6U/g的AMP脫氨酶，純化后，AMP脫氨酶的最適溫度和pH分別為40℃和6.0，且會被Fe3+、Cu2+、Al3+和Zn2+部分抑制。通過應(yīng)用AMP脫氨酶表達系統(tǒng)，添加6mL的粗酶液即可從2.04mg/g的干酵母中獲得2.00mg/g的IMP，40min后摩爾產(chǎn)率可達84.8%。這些結(jié)果為生產(chǎn)AMP脫氨酶提供了新的見解，也為5'-IMP的生產(chǎn)提供了一個潛在的平臺。

1、AMP脫氨酶產(chǎn)生菌的分離和鑒定

10株菌株能分泌1000.0U/g以上的AMP脫氨酶麩曲，其中產(chǎn)酶活性最高的菌株為GX-AD01，可分泌3471.2u/gAMP脫氨酶麩曲。同時，對胞外蛋白酶的活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)菌株GX-AD03的蛋白酶活性最低，達到464.2U/g麩曲。不樂觀的是，表現(xiàn)出最高AMP脫氨酶活性的菌株GX-AD01也產(chǎn)生了較高的蛋白酶活性，可達2598.7U/g麩曲。因此，根據(jù)AMP脫氨酶/蛋白酶的比例，篩選出AMP脫氨酶和蛋白酶活性分別為3191.6和749.0 U/g的麩曲的菌株GX-AD08為本研究AMP脫氨酶的潛在生產(chǎn)菌（表2）。

此外，還對GX-AD08的遺傳穩(wěn)定性進行了研究，在六次重復傳代后，其AMP脫氨酶產(chǎn)生能力具有顯著穩(wěn)定性。此外，根據(jù)其16S rDNA序列對菌株GX-AD08進行了分類鑒定，與米曲霉3811具有99%的同源性。因此，生理學和系統(tǒng)發(fā)育實驗表明，菌株GX-AD08屬于A. oryzae，被命名為A. oryzae GXAD08。

2、AMP脫氨酶的純化及分子量

為了獲得高純度的AMP脫氨酶, 通過超濾、硫酸銨沉淀、DEAE纖維素柱層析和sephacryl S-200柱層析對其進行純化（圖1）。結(jié)果表明，粗AMP脫氨酶的總活性從346473.2 U顯著降低至50400.0 U，而蛋白質(zhì)產(chǎn)量從164.6 mg顯著降低至0.23 mg，但其比活性顯著提高103.9倍，達到219130.4 U/mg蛋白質(zhì)(表3) 。隨后，通過SDS-PAGE對純化的酶進行評估分析，獲得了單個蛋白條帶，結(jié)果表明酶純度明顯提高。為了評估AMP脫氨酶的分子量（MW），測量了標準蛋白質(zhì)的分子量與其相對遷移距離之間的關(guān)系（圖S3），然后計算出AMP脫氨酶的分子量為85.39 kDa。

3、AMP脫氨酶的酶學性質(zhì)

pH 值對純化 AMP 脫氨酶的酶活性和穩(wěn)定性的影響如圖 2 所示。AMP脫氨酶的最適pH為6.0，在pH值在4.0-6.0范圍內(nèi)時，隨著pH值的升高，活性逐漸增強，但隨著pH值從6.0進一步升高到10.0，活性顯著降低.（圖2a）。在4℃下培養(yǎng)6小時后，pH值為4.0-8.0時超過85%的酶具備剩余活性，但該酶在pH值為10.0時完全失活（圖2b）。此外，測定純化AMP脫氨酶的最佳培養(yǎng)溫度為40℃（圖2c）。然而，熱穩(wěn)定性實驗表明AMP脫氨酶在25℃以下保持穩(wěn)定，但在60℃以上完全失活（圖2d）。因此，該酶在菌株A . oryzae GX-AD08的培養(yǎng)溫度下是穩(wěn)定的（32℃）。此外，圖2e還研究了不同金屬離子對酶活性的影響。結(jié)果表明，5mmFe3+和Zn2+可使AMP脫氨酶活性分別顯著降低72.7%和59.2%，而5mmCa2+、K+、Co2+和Mn2+對AMP脫氨酶活性無影響。因此，金屬離子對AMP脫氨酶活性沒有表現(xiàn)出刺激效應(yīng)，這與以前的報道不一致。測量純化AMP脫氨酶的Vmax和Km值，分別達到0.138 mM/min/mg和0.223 mM，這與其他天然酶的值相同。以上結(jié)果表明來自A. oryzae的AMP脫氨酶具有優(yōu)良的酶促反應(yīng)動力學參數(shù)，表現(xiàn)出具有生產(chǎn)IMP的巨大潛力。

4、AMP脫氨酶的催化特性

為了進一步評估AMP脫氨酶的工業(yè)潛力，采用高效液相色譜法測定了其催化性能。如圖S4所示，純化的AMP脫氨酶能夠以足夠的特異性有效催化IMP的產(chǎn)生，因此僅獲得兩個HPLC峰，這表明在與AMP脫氨酶的酶促反應(yīng)過程中沒有副產(chǎn)物產(chǎn)生。另外，當AMP脫氨酶產(chǎn)生系統(tǒng)在30-L固體發(fā)酵系統(tǒng)（32°C，pH 6.0，培養(yǎng)基D）中擴增時，以酵母粉為底物研究粗酶的催化能力。如表4所示，隨著AMP脫氨酶的加入，AMP的含量逐漸降低，而 IMP的濃度相應(yīng)增加。例如，當添加6ml的AMP脫氨酶時，AMP（2.04mg/g干酵母）的含量可有效轉(zhuǎn)化為IMP（2.00mg/g干酵母），轉(zhuǎn)化率為84.8%。更重要的是，當加入AMP脫氨酶時，GMP的濃度沒有變化，表明來自于A. oryzae GX-AD08的AMP脫氨酶對AMP具有良好的催化能力和催化特異性。

總結(jié)

本研究純化得到了一種來源于米曲霉的AMP脫氨酶，其最適溫度和pH值分別為40℃和6.0。當應(yīng)用AMP脫氨酶表達系統(tǒng)時，粗酶液可以有效催化IMP的合成，轉(zhuǎn)化率達到84.8%。然而，仍存在一些因素會限制AMP脫氨酶的工業(yè)化生產(chǎn)，包括其在工業(yè)條件下（有機溶劑的存在、高溫等）的不穩(wěn)定性，以及與其它類似蛋白質(zhì)結(jié)合的產(chǎn)物。為此，可將酶固定在載體上，從而提供一種可改善AMP脫氨酶性能的替代途徑，包括其穩(wěn)定性、活性、特異性和選擇性。固定化結(jié)合基因操作和支持設(shè)計等領(lǐng)域的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)化學、有機化學、反應(yīng)器和反應(yīng)設(shè)計應(yīng)成為改善AMP脫氨酶作為工業(yè)生物催化劑的不同特性的日益流行的工具。