115939-25-8 / 丹酚酸B的藥理作用及應(yīng)用

背景及概述^[1-2]

心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，該病具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高”等特點(diǎn)，目前已成為導(dǎo)致人類死亡的頭號病因。因此，尋找能夠有效治療心血管病的藥物成為了臨床面臨的首要問題。傳統(tǒng)的活血化瘀中藥丹參，因其具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)的功效，目前已被廣泛用于心血管疾病的治療。研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸(salvianolicacids)是丹參(拉丁學(xué)名：salviamiltiorrhizabunge)中含量最豐富的水溶性物質(zhì)，而丹酚酸B則是丹酚酸中含量最多、生物活性最強(qiáng)的化合物。研究表明，丹酚酸不僅對心肌缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用，同時對心肌梗死及心肌細(xì)胞肥均有保護(hù)作用。

藥理作用及應(yīng)用

1. 丹酚酸B在心血管疾病中作用

1）丹酚酸B對心肌梗死的保護(hù)作用：采用冠狀動脈結(jié)扎方法構(gòu)建大鼠心肌梗死(myocardialinfarction，MI)模型，考察丹酚酸B對MI的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，與對照組相比，丹酚酸B能夠?qū)I發(fā)揮明顯的心臟保護(hù)作用。機(jī)制研究表明，丹酚酸B主要通過抑制瘦素和內(nèi)皮素－活性氧簇(ET-ＲOS)的上調(diào)以及恢復(fù)心肌中心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a(sarco/endoplasmicreticulumATPase2a，SEＲCA2a)和受磷蛋白的正常表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)心臟的作用。

2）丹酚酸B對MI/Ｒ損傷的保護(hù)作用：MI/Ｒ時會產(chǎn)生大量自由基，使得細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，膜流動性和通透性發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致電生理活動異常，誘發(fā)和促進(jìn)心律失常的產(chǎn)生。由于心肌細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，致使心肌缺血區(qū)的過氧化產(chǎn)物如丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增多；冠脈流出液中乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase，LDH)和肌酸磷酸激酶(creatinephosphokinase，CPK)升高以及心肌組織中超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)減少。研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能夠明顯提高M(jìn)I/Ｒ損傷大鼠心肌組織中的SOD活力，可有效對抗氧自由基引起的毒害作用，從而減輕心肌細(xì)胞的損傷。通過構(gòu)建大鼠MI/Ｒ模型考察丹酚酸B對MI/Ｒ損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，給予丹酚酸B能夠明顯增加血漿中肌鈣蛋白(troponins，CTn)、肌酸激酶同工酶(creatinekinase-MB，CK-MB)的含量，同時明顯降低血漿中一氧化氮(nitricoxide，NO)和總超氧化物歧化酶(totalsuperoxidedismutase，TSOD)的水平，表明丹酚酸B對大鼠MI/Ｒ損傷有明顯的保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能夠緩解氧化應(yīng)激、減少鈣超載以及改善內(nèi)皮功能。

3）丹酚酸B具有抑制心肌細(xì)胞肥大的作用：考察丹酚酸B對血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)的新生大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響，結(jié)果表明，丹酚酸B能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的肥大，同時發(fā)現(xiàn)心鈉素和腦鈉素mＲNA表達(dá)下降及細(xì)胞表面積減少。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能夠抑制聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1［poly(ADP-ribose)polymerase-1，PAＲP-1］的活性；同時發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PAＲP-1能夠減弱丹酚酸B抗心肌細(xì)胞肥大的效應(yīng)，這些研究表明丹酚酸B具有很好的抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。

4）丹酚酸B能夠抑制動脈粥樣硬化的形成：通過實(shí)驗考察了丹酚酸B對動脈粥樣硬化的作用，結(jié)果表明用丹酚酸B處理血管平滑肌細(xì)胞可有效抑制血小板衍生生長因子(platelet-derivedgrowthfactor，PDGF)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和遷移，同時可明顯增加血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)的表達(dá)；與此同時，丹酚酸可明顯減少活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ＲOS)的產(chǎn)生及降低煙酰胺腺嘌呤二核

苷酸磷酸/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)的比率。用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能夠明顯誘導(dǎo)HO-1的產(chǎn)生，同時有效的抑制腫瘤壞死因子-α(tumornecrosisfactor，TNF-α)誘導(dǎo)的nuclearfactor-κB(NF-κB)的激活；而采用siＲNA抑制HO-1的表達(dá)可消除丹酚酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，同時阻斷了HO-1缺失細(xì)胞的增殖、遷移和炎癥。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，丹酚酸B是通過活化核因子E2相關(guān)因子(nuclearfactor-E2-relatedfactor2，Nrf2)，進(jìn)而誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，從而抑制血管細(xì)胞的增殖、遷移和炎癥，進(jìn)而發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用。

5）丹酚酸B能夠有效降低門靜脈高壓：采用內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)誘導(dǎo)小鼠門靜脈高血壓，考察丹酚酸B對門脈高壓小鼠肝臟內(nèi)血液微循環(huán)的影響，結(jié)果表明，與對照組相比，丹酚酸B能夠明顯降低門脈高壓小鼠肝臟內(nèi)的平均血流和微循環(huán)流速，進(jìn)而發(fā)揮降低門脈高壓的作用。研究表明，丹酚酸B能夠降低大鼠的門靜脈高壓，并且研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B主要是借助大鼠肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞而發(fā)揮作用。

2. 丹酚酸B調(diào)控心血管效應(yīng)的機(jī)制

1）Akt-eNOS信號介導(dǎo)丹酚酸B對MI/Ｒ損傷的保護(hù)作用：研究發(fā)現(xiàn)，Akt-eNOS是再灌注損傷補(bǔ)救酶(reperfusioninjurysalvagekinase，ＲISK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的組成之一，通過影響下游相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對心臟產(chǎn)生保護(hù)作用。在這一通路中，Akt處在中心環(huán)節(jié)，也是最主要的靶酶，只有磷酸化的Akt才能發(fā)揮一系列的生物活性。通過結(jié)扎冠狀動脈制備大鼠MI/Ｒ損傷模型，考察丹酚酸B對MI/Ｒ損傷大鼠的保護(hù)作用，研究表明，丹酚酸B可增加Akt的磷酸化水平進(jìn)而導(dǎo)致其活化，活化的Akt進(jìn)一步激活其下游靶標(biāo)eNOS使其磷酸化，進(jìn)而通過下游一系列的生物效應(yīng)發(fā)揮對MI/Ｒ損傷的保護(hù)作用。

2)TLＲ4-NFκB-TNF-α炎癥通路介導(dǎo)丹酚酸B保護(hù)心肌細(xì)胞損傷：通過用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞炎癥損傷，并探討丹酚酸B對心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予LPS后該組的乳酸脫氫酶和腫瘤壞死因子-α的濃度明顯高于其他組，表明造模成功；而給予丹酚酸B處理后，LDH和TNF-α的濃度明顯下降。與此同時，免疫組化結(jié)果顯示，給予LPS后，Toll樣受體4(toll-likereceptors，TLＲ4)和NF-κB的表達(dá)明顯升高；而給予丹酚酸B后，TＲ4和NF-κB的表達(dá)明顯下降。說明在用LPS誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞損傷的早期階段，TLＲ4-NF-κB-TNF-α通路被迅速激活，而丹酚酸B發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞損傷的作用，很可能是通過抑制該通路來實(shí)現(xiàn)的。

3）自噬介導(dǎo)丹酚酸B保護(hù)心肌細(xì)胞損傷：通過實(shí)驗考察自噬對饑餓心肌細(xì)胞的影響，同時觀察丹酚酸B對饑餓心肌細(xì)胞中自噬的效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞饑餓3h后會誘發(fā)自噬，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并且發(fā)現(xiàn)饑餓細(xì)胞中的LC3-Ⅱ的表達(dá)呈現(xiàn)時間依賴性的增加；而給予丹酚酸B后，能夠明顯抑制LC3-Ⅱ的增加，同時細(xì)胞活力及心肌細(xì)胞中ATP的水平也明顯增加。該研究表明丹酚酸B能夠通過阻斷過度自噬，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用。

4）線粒體凋亡途徑介導(dǎo)丹酚酸B抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞的凋亡：通過結(jié)扎冠脈左前降支構(gòu)建大鼠心肌梗死模型，進(jìn)而考察丹酚酸B對心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，丹酚酸B可以明顯降低心肌細(xì)胞的凋亡率。作者進(jìn)一步考察丹酚酸B對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹酚酸B可以明顯降低Bax的表達(dá)，同時發(fā)現(xiàn)丹酚酸B也明顯降低了STAT-3及IL-6的表達(dá)。這表明線粒體凋亡途徑參與調(diào)控了丹酚酸B抑制心肌梗死后心肌細(xì)胞的凋亡。

制備^[3-4]

方法1：一種高純度丹酚酸B的制備方法：

a.首先將中藥材丹參粉碎，第一次在去離子水100度微沸的條件下加入粉碎的丹參提取1小時，用丹參重量5倍量的水；然后在小于50度PH1—6.5的條件下提取2---3次，每次時間40分鐘，用丹參重量3倍量的水；

b.提取液過濾后通過大孔吸附樹脂層析，用水洗脫后，用20---90％的C1---C5的低級醇解吸，將解吸液減壓濃縮后，得到丹酚酸B的粗品；

c.丹酚酸B的粗品進(jìn)一步經(jīng)纖維素層析，以低級醇或丙酮洗脫，以水或C1---C5的低級醇解吸，合并含丹酚酸B的組分，減壓濃縮，冷凍干燥，得到高純度的丹酚酸B。

d.在a、b、c步驟中要用PH值調(diào)節(jié)物質(zhì)將PH值調(diào)節(jié)至1—6.5。

方法2：一種采用鹽析制備高純度丹酚酸B的方法，包括以下步驟：

（1）將丹參粉碎后用醇溶劑、水或醇水混合液提取，過濾并減壓濃縮后獲得膏狀丹參粗提物；

（2）將膏狀丹參粗提物經(jīng)過簡單的純化處理得到膏狀丹酚酸B粗提物；所述純化處理采用沉淀、萃取、大孔樹脂層析、正向色譜或反向色譜；沉淀法包括酸沉、水沉和醇沉，水沉是將水不溶的低極性雜質(zhì)沉淀析出，醇沉是將醇不溶的雜質(zhì)沉淀析出，酸沉是將酸性條件下不溶的雜質(zhì)沉淀析出。大孔樹脂包括弱極性和非極性樹脂如D101、AB-8、HPD-100等。反相色譜填料包括反相硅膠和反相樹脂如C₁₈硅膠、CG161、葡聚糖凝膠LH-20等。

（3）將膏狀丹參粗提物或膏狀丹酚酸B粗提物溶于有機(jī)溶劑，得到丹酚酸B粗溶液，在緩慢攪拌下滴加成鹽劑，成鹽pH為3-4，成鹽溫度為25-45℃，析出沉淀丹酚酸B鹽；所述丹酚酸B粗溶液中的含固量為10~30%（重量百分比），所述丹酚酸B粗溶液中丹酚酸B的重量百分比含量為5~80%，成鹽劑的摩爾量為丹酚酸B摩爾量的1-2.5倍，成鹽劑為弱堿溶液及鉀、鈉、鈣、鎂、氨、胺的有機(jī)鹽溶液或鉀、鈉、鈣、鎂、氨、胺的碳酸鹽溶液；所述有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、乙腈、四氫呋喃、二氧六環(huán)、二甲亞砜、甲酰胺或乙酸乙酯中一種或兩種，以乙酸乙酯和無水乙醇的混合溶液為佳；

（4）將丹酚酸B鹽經(jīng)酸析脫鹽法、萃取脫鹽法或大孔樹脂層析脫鹽法脫鹽，干燥后獲得高純度的丹酚酸B。

主要參考資料

[1] 丹酚酸B在心血管疾病中藥理作用研究進(jìn)展

[2] 丹酚酸B的藥動學(xué)及相關(guān)研究進(jìn)展

[3] CN200710144939.5高純度丹酚酸B、制備方法及其應(yīng)用

[4] CN201510167813.4一種采用鹽析制備高純度丹酚酸B的方法