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苯酚(Phenol，CHOH)是是生產(chǎn)某些樹脂、殺菌劑、防腐劑以及藥物(如阿司匹林)的重要原料，也可用于消毒外科器械和排泄物的處理，還可以用于皮膚殺菌、止癢和中耳炎等，具有廣泛的應(yīng)用范圍。
在生物制品的制備過程中，苯酚是一種優(yōu)良的殺菌劑，其作用機(jī)理為苯酚能夠裂解并穿透細(xì)胞壁，與菌體蛋白結(jié)合，引起蛋白變性，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)菌體的滅活。然而，由于苯酚毒性較大，苯酚在生物制品中對生物制品的質(zhì)量也會(huì)產(chǎn)生一定的影響，因此在中間產(chǎn)品加工為成品之前需要對中間產(chǎn)品中的苯酚含量加以測定。
一種高效液相色譜檢測生物制品中苯酚含量的方法，包括以下步驟：
①樣品制備：量取適量生產(chǎn)批號為A20170702的A群腦膜炎多糖溶液，用孔徑為0.45μm的濾膜過濾，得到樣品；
②儀器檢查：按洗脫的初始體積比將流動(dòng)相A和流動(dòng)相B接入高效液相色譜儀的C色譜柱中平衡，檢查高效液相色譜儀的各個(gè)系統(tǒng)，確保儀器正常，其中，流動(dòng)相A為1.0‰TFA-乙腈溶液，流動(dòng)相B為1.0‰TFA-水溶液；
③檢測前準(zhǔn)備：設(shè)置高效液相色譜儀的色譜條件，其中，壓力警戒為3.5bar、檢測波長為280nm、流速為1.0mL/min、進(jìn)樣量為40μL、柱溫為24℃；隨后繼續(xù)按初始體積比將流動(dòng)相A和流動(dòng)相B接入C色譜柱中，直至C色譜柱內(nèi)的各物質(zhì)含量達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡；
其中，對于流速和進(jìn)樣量的選擇，進(jìn)行了無數(shù)次摸索試驗(yàn)，其中在流速為0.5-1.0mL/min、進(jìn)樣量為40-100μL時(shí)色譜峰峰形良好。
④苯酚洗脫：將步驟①中得到的樣品加入至步驟③中已平衡的C色譜柱中，按流動(dòng)相A和流動(dòng)相B之間的體積比的不同分成七個(gè)洗脫階段，依次對樣品中的苯酚進(jìn)行梯度洗脫，記錄色譜圖，隨后經(jīng)分析計(jì)算得出樣品中苯酚的吸收峰面積為230.43；
其中，上述的七個(gè)洗脫階段按體積百分?jǐn)?shù)計(jì)，見下表1所示依次進(jìn)行梯度洗脫：
⑤繪制線性回歸方程：精密量取分別精密量取40μL的濃度依次為0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL的苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液作為標(biāo)準(zhǔn)對照液，將各組標(biāo)準(zhǔn)對照液分別按照步驟④中的七個(gè)洗脫階段進(jìn)行梯度洗脫，記錄色譜圖，測得標(biāo)準(zhǔn)對照液的吸收峰面積，最后以標(biāo)準(zhǔn)對照液濃度為橫坐標(biāo)、以吸收峰面積為縱坐標(biāo)制作的線性回歸方程，具體為Y＝27.8037x+59.6158，線性相關(guān)系數(shù)r＝0.99993，呈良好線性關(guān)系，當(dāng)樣品中的苯酚超過此線性范圍時(shí)，可適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù)。
⑥苯酚含量測定：將步驟④所得的苯酚的吸收峰面積代入步驟⑤中線性回歸方程中，計(jì)算得到樣品中苯酚的含量為6.1436μg/mL。
[1] [中國發(fā)明] CN201811192272.0 一種高效液相色譜檢測生物制品中苯酚含量的方法