10127-02-3 / 吖啶橙的賦存狀態(tài)及發(fā)光機理

背景及概述^[1-2]

吖啶橙又名3，6-雙(二甲胺基)吖啶鹽酸鹽。橙色粉末，其水溶液和醇溶液均為橙黃帶綠色熒光。吖啶橙(AO)是一種常用的三環(huán)芳香類陽離子型的堿性熒光染料。常用于細胞內(nèi)DNA與RNA的定量測定及活細胞的染色及其它熒光分析。AO的吸收、熒光光譜及強度會受其結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素(待測物、溶劑、酸堿性、濃度和溫度)的影響而發(fā)生變化。例如，AO與DNA作用時，激發(fā)最大波長502nm，發(fā)射最大525nm(綠光)。與RNA作用時，激發(fā)最大波長移動到460nm(藍光)，發(fā)射最大移動到650nm(紅光)。當溶液的性質(zhì)發(fā)生變化，AO的吸收與熒光光譜就會發(fā)生變化。溶劑效應的研究與分析有利于理解環(huán)境效應和溶液中激發(fā)態(tài)分子的去激發(fā)作用和馳豫現(xiàn)象及發(fā)光機理。

吖啶橙的結(jié)構(gòu)及與H+或OH-相互作用^[2]

AO分子含有給電子基團二甲胺基，而且環(huán)上的氮原子并未參與成鍵，仍以sp2雜化，與苯環(huán)形成n-π共軛，因此，吖啶環(huán)上N原子易發(fā)生季銨堿反應。AO與H+或OH-相互作用，于是，AO可以看作為具有共軛酸堿型的熒光染料，酸性基團的離解作用或堿性基團的質(zhì)子化作用，可能改變與發(fā)光過程相競爭的非輻射躍遷過程的性質(zhì)和速率，也會改變AO在水溶液中氫鍵的形成能力，從而影響化合物的熒光光譜和強度。

賦存狀態(tài)及發(fā)光機理^[2]

1）賦存狀態(tài)

為了進一步探討AO在溶液中的聚集狀熒光強度值變化曲線，檢測了不同濃度的AO的熒光光譜，考察熒光λmax的變化。在稀AO溶液中，熒光強度最大。隨AO濃度增大，熒光強度越弱。相對稀溶液AO的熒光光譜，濃度大的AO熒光λmax紅移。這可解釋吖啶橙在稀溶液中呈綠色；在濃溶液中，呈現(xiàn)橙紅色，是因在濃溶液中出現(xiàn)二聚體和多聚體。這說明在稀溶液中只有AO單體，在較高濃度的溶液中，AO單體與AOAO二聚體形式共存，在高濃度溶液中，AO單體很少，主要以AOAO二聚體或(AO)n多聚體形式存在。AO在低濃度水溶液中比在高濃度易形成氫鍵，其熒光光譜向短波方向移動。

2）發(fā)光機理　

AO分子存在給電子取代基[─N(CH3)2]上的非鍵孤對電子，在AO分子中存在n-π＊躍遷和分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移躍遷，與雜氮芳環(huán)之間存在著激發(fā)態(tài)電荷轉(zhuǎn)移作用而擴大了共軛體系，導致熒光光譜在水溶液中向長波方向移動。溶液pH的變化，對AO上的非鍵孤對電子有影響。AO質(zhì)子化作用使得共軛體系范圍減小，導致熒光光譜在水溶液中向短波方向移動，AO離解作用又使得激發(fā)態(tài)內(nèi)電荷發(fā)生轉(zhuǎn)移而擴大了共軛體系，導致AO在堿性條件下熒光光譜向長波方向移動，熒光強度降低。溶液氫鍵的形成能力的光譜位置有較大影響，隨著氫鍵的形成能力增大，最低激發(fā)態(tài)單重態(tài)與基態(tài)之間的能量間隙增大，熒光光譜向短波方向移動。

應用^[3-5]

在分析化學中用作熒光指示劑，也用于腫瘤細胞及細菌等染色。市售品也有為硫酸鹽者。其應用舉例如下：

1）吖啶橙共振光散射法測定脫氧核糖核酸。有實驗研究了吖啶橙與DNA作用的共振散射光譜，發(fā)現(xiàn)在pH11的堿性溶液中痕量核酸對吖啶橙的共振散射光產(chǎn)生增強作用，且增強程度與核酸濃度之間有良好的線性關系。據(jù)此建立了測定核酸的高靈敏共振光增強分析方法。其最大散射波長均位于324nm處，測定魚精DNA(fsDNA)的線性范圍是3.1×10-8～7.3×10-6g·mL-1，檢測限20.5ng·mL-1，測定小牛胸腺DNA(ctDNA)的線性范圍是7.5×10-8～9.8×10-6g·mL-1，檢測限20.8ng·mL-1。該方法簡單，操作方便，選擇性好，靈敏度高，用于合成樣品的測定結(jié)果滿意。

2）吖啶橙分光光度法測定雙酚A。在酸性介質(zhì)中，雙酚A對羥基自由基氧化吖啶橙的反應具有抑制作用，據(jù)此建立了測定雙酚A含量的分光光度分析方法。確定了最佳實驗條件，在此條件下得到吖啶橙溶液吸光度的變化值與雙酚A濃度的線性關系，其線性范圍為10~200ng/mL，工作曲線為ΔA=0.643logρ-0.544，線性相關系數(shù)為0.9991，檢出限為1.05ng/mL。應用本法測定4種塑料制品中雙酚A的含量，回收率在95.0%~104.3%之間，RSD在1.7%~3.1%之間。

3）吖啶橙-氧化石墨烯熒光猝滅法測定多巴胺。在酸性介質(zhì)中氧化石墨烯對吖啶橙的熒光發(fā)生猝滅作用，此時加入適量多巴胺，則導致體系的熒光強度增強，且增強程度與多巴胺的加入量成正比。據(jù)此建立了吖啶橙-氧化石墨烯熒光光度法測定多巴胺的方法。多巴胺的質(zhì)量濃度在0.05~12.0μmol/L范圍內(nèi)呈線性，線性方程為ΔIF=3.9+57.8c(μmol/L)，相關系數(shù)r=0.9933；檢出限為2.9nmol/L。該方法具有良好的選擇性，應用于實際樣品的測定，結(jié)果滿意。

主要參考資料

[1] 化學物質(zhì)辭典

[2] 吖啶橙受溶液pH和濃度變化的光譜研究

[3] 吖啶橙共振光散射法測定脫氧核糖核酸

[4] 吖啶橙分光光度法測定雙酚A

[5] 吖啶橙-氧化石墨烯熒光猝滅法測定多巴胺